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听力损失是严重影响人类生活质量的世界性顽疾之一,目前尚无根治的方法。虽然听力损伤对生命不造成威胁,但耳聋发病率日益增加严重影响患者的生活质量和社会交流能力,给全球的经济发展带来了严重的影响。内耳是一个具有复杂结构且高度特化的感觉器官。内耳毛细胞是内耳中重要的听觉感受器。在人的内耳中,毛细胞容易受到年龄、耳毒性药物、家族遗传疾病、传染性疾病和噪音等因素影响而损伤。内耳毛细胞为终末分化细胞,基本上不具有再生修复能力,由毛细胞损伤引起的感音神经性耳聋往往是不可逆的,造成永久性的耳聋,目前尚无有效的方法从根本上治愈耳聋。因此,对耳聋相关的机制研究和干预治疗迫在眉睫。近几年来,干细胞工程的兴起为感音神经性耳聋的治疗提供了一种新思路。以干细胞诱导分化为基础,利用干细胞相关技术,探讨听觉系统损伤修复特别是毛细胞的损伤和再生已成为可能,有望从根本上解决听力损伤问题。胚胎干细胞是内耳毛细胞再生的重要种子细胞之一。研究证明胚胎干细胞在体外培养条件下仍具有多分化潜能,在合适的诱导条件下可以分化为毛细胞。但是在胚胎干细胞及毛细胞的相关研究中依旧存在很多问题。主要包括：1、需要建立一个简便、高效的将人胚胎干细胞体外诱导分化为内耳祖细胞的体系。2、人胚胎干细胞体外成功分化为毛细胞的诱导体系主要建立在基质细胞共培养的基础上,与基质细胞共培养会对再生毛细胞的后续检测和进一步研究造成一定的干扰。3、Notch信号通路在哺乳动物内耳毛细胞的发育过程中起着非常重要的作用,然而,Notch信号通路毛细胞体外诱导分化过程中是否具有类似的作用?还未可知。因此,本研究的前两部分内容(即第二章和第三章)主要研究如何在在无基质细胞作为饲养层的前提条件下,成功将人胚胎干细胞分化为具有典型静纤毛束和电生理反应的成熟毛细胞。第三部分(第四章),以人胚胎干细胞向毛细胞样细胞体外定向分化的无基质细胞诱导体系为基础,进而研究Notch信号通路中的配体和受体对毛细胞体外诱导分化的影响。第一部分：本研究分别采取了拟胚体组合因子诱导法与单层贴壁诱导法将人胚胎细胞向内耳祖细胞诱导分化,均获得了能够表达内耳前体细胞标志基因和蛋白的内耳祖细胞。这两种诱导方法相比,拟胚体悬浮培养法需要分阶段操作,且诱导阶段耗时相比于单层贴壁诱导法长,因此,我们以单层贴壁诱导法为基础,建立了人胚胎干细胞定向分化为内耳祖细胞的体系,为后续进一步向内耳毛细胞诱导分化奠定了研究基础。第二部分：为了将分化得到的内耳祖细胞进一步诱导分化为具有功能的毛细胞。我们尝试采用不同的基质和诱导培养液,将分离得到的内耳上皮祖细胞(OEPs)向毛细胞样的细胞诱导分化。实验结果表明：以灭活的鸡胚椭圆囊基质细胞作为饲养层,诱导OEPs分化生成的毛细胞表面存在规则排列的静纤毛束。然而,和基质细胞共培养,分化得到的毛细胞中参杂有基质细胞,这将对后续的检测和研究工作造成一定的干扰。为了避免基质细胞的干扰,我们采用层粘连蛋白laminin作为基质替代鸡胚椭圆囊基质细胞,尝试采用不同的诱导培养液将OEPs诱导分化为有功能的毛细胞。结果表明：将OEPs接种在laminin预处理过的培养皿上,用添加了EGF和RA的鸡胚椭圆囊基质细胞的条件培养液作为诱导培养液诱导OEPs向毛细胞分化,生成的毛细胞表面存在成束的规则排列的静纤毛,并经膜片钳检测证明具有电生理功能。这提示我们,在无基质细胞共培养的条件下,人胚胎干细胞在体外可以诱导分化为具有功能的成熟毛细胞。第三部分：在体内,内耳毛细胞的发育过程受到Notch信号通路的调控,在体外诱导分化过程中,毛细胞的分化和发育是否也受到Notch信号通路类似的调控作用,却鲜有研究。了解内耳毛细胞体外分化过程中Notch信号通路的调控作用有助于控制毛细胞的分化。我们以人胚胎干细胞向毛细胞样细胞体外定向分化的无基质细胞诱导体系为基础,进而研究Notch信号通路中的配体和受体对毛细胞体外诱导分化的影响。首先,检测Notch信号通路中各配体和受体在毛细胞诱导分化不同阶段的表达情况,确定Notch信号的表达时序；再依据配体表达的时序,选取在诱导分化过程中不同配体开始表达时的细胞作为靶细胞；用pAJ-U6-shRNA-CMV-Puro/GFP载体,构建Jag-1-shRNA干扰载体的慢病毒分别感染分化6天和分化12天的祖细胞以沉默Jag-1基因。同时,用Jag-2-shRNA和Dll-1-shRNA干扰载体的慢病毒感染分化5天的毛细胞以沉默Jag-2和DlM基因,最后,通过半定量PCR、免疫荧光检测和电镜检测验证沉默Jag-1,Jag-2和Dll-1基因对毛细胞体外诱导分化的影响。实验结果表明：在hESCs向毛细胞体外诱导分化的体系中,Jag-1配体主要参与内耳祖细胞的体外分化的过程。而Jag-2配体和Dll-1配体主要参与毛细胞的体外分化的过程,并对毛细胞的分化和发育起着一定的抑制作用。当Jag-2配体和Dll-1配体单独受到干扰时,对毛细胞体外分化的影响不显著,而当两者同时受到干扰时,较为明显地促进毛细胞的体外分化,且抑制了支持细胞的分化。因此,我们认为Jag-2配体和Dll-1配体可能是协同作用的。本章研究主要是为进一步研究毛细胞的体外诱导体系中Notch信号通路的作用机制奠定了一定的理论基础。