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磷酸化是蛋白质翻译后修饰的重要方式之一,特别是在真核细胞中,蛋白的可逆磷酸化过程调节细胞间的信号传导,调控细胞生长、代谢、分化和凋亡,识别分子等。因此,鉴定蛋白的磷酸化位点对解读细胞的调控过程有重要的意义。具有较高的灵敏度的质谱仪常常作为磷酸化蛋白组学研究的重要工具,然而,由于生物体内磷酸化蛋白质的含量很低,蛋白酶解后的混合肽段中磷酸化肽段的离子化效率不高,以及共存的大量非磷酸化肽段对其质谱信号的抑制,使得磷酸化肽段的鉴定及其位点分析变得异常困难。因此,在质谱分析之前,从蛋白酶解产物中选择性地富集磷酸化肽段显得尤为重要。常见的磷酸化肽段的富集方法有:金属氧化物亲和色谱法,金属离子亲和色谱法,强阴/阳离子交换色谱法等。另外,在蛋白的磷酸化位点鉴定过程中,酶解是散弹技术必经的一个步骤,常规的溶液酶解存在着耗时长等缺点。
针对以上问题,第一个研究工作提出磷酸化蛋白的快速酶解与磷酸化肽段的选择性富集联合的方法,分析鉴定磷酸化蛋白。以介孔二氧化硅纳米管为基体(MSN),进行两种功能化修饰(胰蛋白酶(TEMSN)或二氧化锆层(ZrO2/MSN)),前者应用于磷酸化蛋白的快速酶解(3min),后者应用于从混合肽段中分离富集磷酸化肽段。ZrO2/MSN从β-酪蛋白的混合肽段中富集磷酸化肽段,检测灵敏度为2.5fmol。TEMSN与ZrO2/MSN联合的方法,分析α-酪蛋白与牛奶实际样品中蛋白的磷酸化位点,取得良好的效果。
第二个研究工作从提高材料的生物相容性和环境敏感性入手,设计合成温敏性锆离子亲和材料-锆离子功能化的包覆温敏聚合物的二氧化硅纳米粒子(Zr4+@P(NIPAM-co-VPA)@silica),该材料在小于相转移温度的条件下,表面为良好的亲水性和生物相容性。材料应用于β-酪蛋白的酶解液中磷酸化肽段的富集,检测灵敏度为25fmol。