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我们以前的研究结果已证明,在芹菜夜蛾核型多角体病毒(Syngrapha falcifera multiple nuclear polyhedrosis virus,SfaMNPV)诱导斜纹夜蛾(Spodoptera litura Cells,SL-1)细胞凋亡过程中,细胞色素c(Cytochrome c,cytc)随着诱导时间的延长,不断从线粒体释放到细胞质中。本实验仍然以SfaMNPV诱导SL-1细胞的凋亡系统为研究对象,利用环孢菌素A(Cyclosprin A,CSA)对线粒体膜完整性的保护作用,进一步研究了cytc对此凋亡系统的影响作用。完成的工作包括以下几个方面: (1) cytc的释放与线粒体膜电位的关系 用流式细胞仪检测线粒体膜电位(ΔΨm)的变化,并用western检测线粒体与细胞质中cytc的变化。结果表明病毒感染4hr后即出现膜电位的下降,且下降趋势呈时间依赖性;而病毒加CSA处理后的细胞其线粒体膜电位下降趋势并不明显。Western检测到病毒感染实验组,随感染时间的延长,线粒体中cytc的量逐渐降低,细胞质中cytc的量逐渐升高;而病毒加CSA处理组,线粒体中cytc的量并没有随着感染时间的延长而明显降低,即CSA抑制了线粒体膜电位的降低和cytc从线粒体到细胞质的转位。这表明在SfaMNPV这种凋亡诱导因子的作用下,cytc从线粒体到细胞质的转位可能依赖于线粒体膜的通透性。 (2) cytc对caspase-3的活性及凋亡形态的影响 对caspase-3的活性检测,首先用caspase-3特异性序列人工合成荧光底物AC-DEVD-AFC与所提取的细胞裂解液成份反应,置荧光分光光度计上检测,结果显示SfaMNPV感染4小时后即检测到caspase-3的活性,且其活性呈时间依赖性增强。用caspase-3兔抗多克隆抗体进行western检测,procaspase-3的表达量逐渐减少,即caspase-3活性逐渐增加。而病毒加CSA处理组的荧光强度值与procaspase-3的表达量都没有明显的变化。表明CSA抑制了caspase-3的活性。 对细胞凋亡形态学观察,分别对三个实验组的细胞进行DAPI染色,DNA电泳,置荧光显微镜下与紫外灯下观察、拍照,其结果显示CSA处理后的细胞经DAPI染色未被检测到凋亡小体,DNA电泳也未检测到有梯形条带。我们的实验还证明了在处理时间范围内CSA本身对细胞并不致死,因此我们推测CSA保护了线粒体膜的完整性,抑制cytc从线粒体释放到细胞质中,从而抑制caspase-3的活化与DNA片段化的下游事件,这提示了cytc在杆状病毒诱导昆虫细胞凋亡中的重要作用。