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[目 的]肺炎克雷伯菌是重要的条件致病菌和医源性感染菌之一,当机体的免疫力下降则会引起机体各系统感染,随着越来越多的肺炎克雷伯菌的耐药和高毒力合并的情况被发现,其感染的严重及治疗的困难给临床的治疗带来了很大的挑战。所以本研究针对高毒力与耐药(耐碳青霉烯)合并的肺炎克雷伯菌的分子机制进行深入探索。[方 法]]1.收集了 2015年1月-2017年12月来自昆明医科大学第二附属医院对临床标本分离出的耐碳青霉烯肺炎克雷伯菌。前期实验已对肺炎克雷伯菌的MLST的分型、耐药表型进行过检测。本实验将肺炎克雷伯菌分为高毒力肺炎克雷伯菌和耐药肺炎克雷伯菌,对碳青霉烯的相关耐药基因blaIMP、blaVIM、blaSPM、blaNDM、blaKPC、blaBIC、blaAIM、blaGIM、blaSIM、blaDIM基因及对rmpA、rmpA2、iucA、iroN的4个相关毒力基因采用PCR方法进行检测,并测序验证,以携带毒力基因rmpA、rmpA2来确定菌株是否含有毒力质粒。分析比较肺炎克雷伯菌耐药菌株与高毒力菌株之间的pLVPK毒力质粒携带情况,初步判断其耐药与毒力情况,为下一步研究筛选耐药菌高毒力菌株提供依据。2.通过对高毒力耐药肺炎克雷伯菌的筛选结果可从中挑选1株ST65型的高毒力的耐药菌株63号、1株ST11型的耐药的高毒力菌株26号为实验组,以NTUH-k2044为阳性对照组,以生理盐水为正常对照组,对小鼠做相关的毒力实验,将对数生长期的肺炎克雷伯菌用生理盐水配制成0.5麦氏(108cfu/mL),用生理盐水依次稀释到 108、107、106、105、104、103、102cfu/mL 的浓度,以每组 8 只 BARB/C小鼠每只0.5mL进行腹腔注射,观察小鼠7天LD50值,对小鼠的肝、肺、脾、肾进行HE染色,以此比较耐药株获得高毒力质粒与高毒力株获得耐药质粒菌株间的毒力差异。3.根据前一部分的研究可知耐药株获得高毒力质粒的菌株与高毒力株获得耐药质粒的菌株间存在毒力差异,且高毒力株获得耐药质粒菌株的毒力比耐药株获得高毒力质粒的菌株的毒力高,所以从菌株中分别挑选出两株ST65、两株ST23和两株ST11型共6株菌,包含了前一部分对小鼠进行毒力实验的菌株,其编号分别63、66、24、77、26、110。对6株肺炎克雷伯菌进行全基因组测,通过全基因组测序分析影响其耐药与毒力的相关因子从而探究造成高毒力获得耐药质粒菌株的毒力与耐药获得高毒力质粒菌株的毒力差异的分子机制。[结 果]1.本研究根据147株耐碳青霉烯肺炎克雷伯菌ST分型将肺炎克雷伯菌分为了高毒力菌株和耐药菌株,其中高毒力菌株总共有9株,占了 6.12%,耐药菌株共有138株,占93.88%。耐药肺炎克雷伯菌的耐碳青霉烯基因检测中,含耐药基因的菌株为136株,占98.55%,其中均未含耐药基因的有2株,占1.46%。耐药菌株中含1种耐药基因的菌株最多,有90株(65.69%);含3种耐药基因的最少,有2株(1.46%)。9株高毒力肺炎克雷伯菌耐碳青霉烯耐药基因检测中,含耐药基因的菌株为9株(100%),其中含1种耐药基因最多,有6株(66.67%),未有菌株含3种耐药基因。138株耐药肺炎克雷伯菌毒力基因中rmpA2的检出率最高,检出了 49株(35.50%),iucA检出率最低,检出5株(3.62%),携带毒力质粒的菌株数为27株(19.57%)。9株高毒力肺炎克雷伯菌中rmpA、rmpA2、iroN和iucA的4种毒力基因均在9株菌中检出,检出率为100%,携带了毒力质粒的菌株数为9株(100%)。高毒力合并耐药菌株共有36株,占所有菌株的24.49%。2.各组用配置好的菌液对BARB/C小鼠进行腹腔注射后,ST65型肺炎克雷伯菌株组7天内102cfu/mL浓度小鼠生存率是12.5%,推测该菌株LD50<0.5X 102cfu,阳性对照组NTUH-k2044菌株在该实验中的LD50为4.8X 104cfu,ST11型菌株在5 X 107cfu计量下可造成小鼠一半的死亡,无法计算LD50值,但可证明其对小鼠产生一定的毒力,从小鼠的毒力实验中可看出三株菌对小鼠的致死率依次为ST65型菌株>NTUH-k2044型菌株>ST11型菌株。ST65型菌株组和NTUH-k2044型菌株组经HE染色可发现对小鼠的肺脏及肝脏造成了不同程度的感染及损害,ST11型菌株组和正常对照组病理检测未发现明显异常。3.通过全基因组测序结果分析6株肺炎克雷伯菌均携带多种耐药基因和毒力基因,6株通过基因组测序分析6株菌均携带耐碳青霉烯基因blaKPC-2基因,其中ST65(66号)型和ST11(110号)型菌株中都携带blaKPC-2基因,虽对亚胺培南和厄他培南耐药,但对美罗培南则不耐药,ST23(77号)型菌株未携带氨基糖苷类的相关基因,但却对氨基糖苷类的药物产生了耐药。ST23(77号)号菌株和ST65(66号)号菌株虽分别携带磺胺类耐药基因和喹诺酮类耐药基因,但其对磺胺类药物和喹诺酮类药物均不耐药。对6株肺炎克雷伯菌进行毒力基因相关分析可发现携带了与粘附功能相关的fimE/A基因,铁摄取系统相关的毒力基因最多,其中包括沙门菌素类的iroN/D/C/B、肠杆菌素类的entA/B/E/S和fepA/B/C/D/G、耶尔森菌素类的fyuA、ybtA/E/T/U/S/P/Q/X和irp1/2、气杆菌素类的iutA、iucA/B/C/D。除了 ST23(24号)型菌株外,均携带与粘附功能相关的fimE/A基因,ST11(26、110号)型的两株菌相比ST65(63、66号)和ST23(77、24号)型的四菌株缺少了气杆菌素及沙门菌素的毒力相关基因。[结 论]1.147株耐碳青霉烯肺炎克雷伯菌ST分型将肺炎克雷伯菌分为了高毒力菌株和耐药菌株,其中高毒力菌株总共有9株(6.12%),耐药菌株共有138株(93.88%)。检测了 10个肺炎克雷伯菌的耐碳青霉烯基因,无论是耐药菌株还是高毒力菌株,都只携带了blaKPC、blaBIC和blaNDM这3个基因,且同时携带多个耐药基因的情况较少见,并且耐药基因的携带数量对耐药表型无明显影响。高毒力肺炎克雷菌rmpA、rmpA2、iroN和iucA的4种毒力基因的携带比耐药肺炎克雷伯菌的比例高,并且所有的高毒力肺炎克雷伯菌均携带毒力质粒。2.肺炎克雷伯菌耐药株获得高毒力质粒的菌株与高毒力株获得耐药质粒的菌株间存在着毒力差异且高毒力株获得耐药质粒菌株的毒力高于耐药株获得高毒力质粒的菌株。3.造成肺炎克雷伯菌耐药株获得高毒力质粒与高毒力株获得耐药质粒菌株间的毒力差异主要原因是因为高毒力株获得耐药质粒菌株携带了气杆菌素和沙门菌素。