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肺癌目前已成为世界上发病率及死亡率最高的肿瘤疾病。肺癌分为小细胞肺癌（small cell lung cancer, SCLC）及非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer,NSCLC）。非小细胞肺癌分为鳞癌、腺癌和大细胞癌等。肺癌的主要确切治疗手段有手术治疗、化疗、放疗和分子靶向治疗。多数肺癌患者在疾病发现时已失去手术机会。肺腺癌倍增时间较短，易转移，对于放化疗均不敏感，且有一定比例的肺腺癌在肿瘤直径<1cm时已发生远端转移。近来，Gefitinib作为分子靶向治疗药物为肺腺癌提供了有效的治疗方法，尽管如此，仍有很大比例的腺癌患者对于EGFR-TKI的治疗效果不佳，因此探寻新的分子靶向治疗方法对于肺腺癌的治疗十分必要。根据目前的研究及报道显示，CLDN家族目前已经拥有27个成员，CLDN6是这个家族的成员之一。之前有研究从胚胎干细胞中采用ddPCR方法筛选了一些交迭的cDNA(20M24)，对20M24的DNA测序结果显示其结构是一段编码219个氨基酸的开放阅读框架，能够指导合成一种分子量大小为23kDa的蛋白，这种蛋白与之前研究中报道的CLDNs的家族成员在结构上具有很高的同源性，因此将其命名为CLDN6。CLDN6位于人类染色体的16p13.3位点，其在维持细胞间TJ结构的完整性及功能中起到了十分关键的作用。有研究发现在乳腺癌细胞MCF-7中稳定过表达CLDN6基因可以抑制乳腺癌细胞的增殖、侵袭和及迁移能力。目前认为CLDNs蛋白在肺癌组织及肺癌细胞中均具有表达特异性。CLDNs家族成员既有部分在肺癌组织及肺癌细胞株中表达上调，又有部分在肺癌组织及肺癌细胞株中表达下调。但CLDNs蛋白在肺癌组织及肺癌细胞中无论表达情况如何，其最终结果总是引起紧密连接的正常结构破坏而导致细胞间分子异常侧向扩散、细胞极性消失等一系列变化。TJ的其他家族成员通过一些特定的信号通路可以影响细胞的生物学行为。有研究显示在乳腺癌MCF-7细胞中过表达CLND6可以激活ASK1/P38通路，从而诱导细胞凋亡。目前有关CLDN6作为TJ的构成蛋白对肺腺癌细胞生物学行为影响的研究尚未见报道，相关机制还不清楚。本研究将首次证实CLDN6作为TJ的构成蛋白对肺腺癌H1299细胞生物学行为的影响及其相关作用机制，不仅对揭示肺腺癌的发生机理有重要意义，并且为肺腺癌的诊断方法及分子靶向治疗药物的研制带来广泛前景。方法：为探讨CLDN6在与肺腺癌的相关性以及CLDN6过表达对肺腺癌细胞H1299生物学表型的影响，本研究采用如下方法：1.鉴定人正常支气管上皮细胞株16Hbe及人肺腺癌细胞株A549、A2和H1299中CLDN6的表达；2.构建CLDN6真核表达载体并转染H1299细胞；3.筛选并鉴定稳定过表达CLDN6的H1299细胞；4.检测CLDN6过表达对H1299细胞增殖能力的影响；5.检测CLDN6过表达对H1299细胞凋亡的影响；6.检测CLDN6过表达对H1299细胞迁移、侵袭和粘附能力的影响；7.检测CLDN6过表达对H1299细胞紧密连接结构和功能的影响；8.分析CLDN6对H1299细胞影响可能的作用机制。结果：1. CLDN6在人正常支气管上皮细胞株16Hbe中有表达，在人肺腺癌细胞株A549、A2和H1299中低表达。2.构建并鉴定了表达绿色荧光蛋白的pIRES2-EGFP-CLDN6质粒。3. CLDN6转染H1299细胞稳定克隆的筛选和鉴定：经荧光显微镜观察、RT-PCR和Western blot方法筛选出3株稳定过表达CLDN6的H1299单克隆，分别为6、10和11号克隆。细胞免疫荧光染色结果发现，CLDN6表达于细胞膜及核膜上，而空载组细胞中无CLDN6的表达。4. CLDN6过表达对H1299细胞增殖的影响：CCK8实验结果显示，过表达组H1299细胞的增殖速度较空载组细胞显著减慢，二维克隆形成实验和三维克隆形成实验结果显示过表达组细胞的克隆形成能力较空载组细胞显著减弱。流式细胞术细胞周期检测结果提示过表达组处于增殖期的细胞比例显著低于空载组。说明转染CLDN6后H1299细胞的增殖速度降低，二维和三维克隆形成能力均显著下降，同时细胞周期也发生了改变。5. CLDN6过表达对H1299细胞凋亡的影响：DAPI染色结果显示，过表达组细胞凋亡率显著高于空载组细胞。Hoechst33342/PI双染法结果发现，过表达组细胞早期和晚期细胞凋亡率均显著高于空载组。流式细胞术进一步证实了上述结果，即与空载组细胞相比，过表达组细胞存在显著增加的凋亡率。说明转染CLDN6诱导了H1299细胞的凋亡。6. CLDN6过表达对H1299细胞转移能力的影响：细胞划痕实验发现，过表达组细胞迁移速度显著低于空载组细胞。Transwell小室法检测发现，空载组细胞的侵袭能力显著大于过表达组细胞，说明CLDN6具有降低H1299细胞体外迁移和侵袭能力的作用。体外粘附能力检测发现，空载组与过表达组细胞间体外粘附能力无显著差别。7. CLDN6基因过表达对H1299细胞紧密连接功能的影响：通过检测单层培养细胞的跨上皮电阻，我们发现，转染CLDN6细胞的跨上皮电阻显著高于空载组细胞，表明转染CLDN6可加强细胞间紧密连接的结构和功能。8. CLDN6基因过表达影响肺腺癌细胞生物学行为的可能机制：Western blot检测发现，CLDN6过表达细胞中磷酸化ASK1和ASK1、磷酸化P38、磷酸化STAT3和STAT3的表达水平显著高于空载组细胞，表明过表达CLDN6可促进P38MAPK途径的活化。应用P38抑制剂SB203580处理过表达组H1299细胞后，CLDN6和ASK1的表达并未受到影响，而STAT3表达显著下降。说明P38位于CLDN6/ASK1信号通路的下游，位于STAT3信号通路的上游。应用P38抑制剂SB203580处理后可以显著抑制上述通路的活化，并逆转过表达CLDN6所致的抑制增殖、促凋亡、抑制迁移和侵袭的能力。因此可以认为CLDN6对细胞增殖、凋亡、迁移和侵袭能力的影响是通过P38信号通路实现的。结论：1. CLDN6在人正常支气管上皮细胞株16Hbe中有表达，在A549、A2和H1299三种人肺腺癌细胞株中低表达。2. CLDN6抑制H1299细胞增殖、迁移和侵袭能力，诱导细胞凋亡。3. CLDN6通过增强细胞间紧密连接功能，抑制H1299细胞的转移能力。4.在肺腺癌细胞H1299中过表达CLDN6可以上调P38的表达。5. CLDN6对H1299细胞生物学表型的作用与P38MAPK信号通路的激活有关。