【摘 要】
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百合具有非常广阔的市场前景,可作为切花、盆栽、庭院植物等。部分百合可用于食品和医药,具有很大的应用价值。百合常规育种多以鳞片扦插进行繁殖,容易造成种质退化、病毒感染等问题,不能满足现代育种的要求。分子育种的不断发展为百合品质性状的改良提供了新的途径。利用CRISPR/Cas9基因编辑技术修饰目标基因,改良百合品质和性状,可高效且便利地实现百合定向育种。本文在优化百合再生体系的基础上,以无菌鳞片为外
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百合具有非常广阔的市场前景,可作为切花、盆栽、庭院植物等。部分百合可用于食品和医药,具有很大的应用价值。百合常规育种多以鳞片扦插进行繁殖,容易造成种质退化、病毒感染等问题,不能满足现代育种的要求。分子育种的不断发展为百合品质性状的改良提供了新的途径。利用CRISPR/Cas9基因编辑技术修饰目标基因,改良百合品质和性状,可高效且便利地实现百合定向育种。本文在优化百合再生体系的基础上,以无菌鳞片为外植体建立了铁炮百合‘萨利’的遗传转化体系。同时以淀粉合成相关酶基因(AGPase)为靶基因,联合采用常规PCR和无缝克隆技术,构建了 CRISPR/Cas9介导的百合AGPase基因编辑载体。本文主要研究结果如下:1、优化了百合再生体系选择亚洲型百合Asiatic lily(L.leucanthum宜昌百合)、东方型百合Oriental lily‘白佩琪’、铁炮型百合Longiflorum lily‘萨利’为材料,采用组织培养的方法,研究激素对不同类型百合愈伤诱导以及芽分化的影响,优化不同类型百合的组培快繁体系,结果表明:宜昌百合在2.0 mg/L的2,4-D和1.5 mg/L 6-BA的处理中,愈伤组织诱导率最高,为70%;‘白佩琪’在6-BA 1.0 mg/L和2,4-D 2.0 mg/L的处理中,诱导率最高,为39.5%;‘萨利’在6-BA 1.5 mg/L和2,4-D 1.0 mg/L的处理中,诱导率最高,为45.5%。在芽分化诱导中,‘萨利’诱导芽分化的最佳处理为6-BA 1.5 mg/L和NAA 0.5 mg/L,芽分化率为68%;宜昌百合诱导芽分化的最佳处理为6-BA0.5 mg/L和NAA0.5 mg/L,芽分化率为55.67%;‘白佩琪’诱导芽分化的最佳处理为6-BA 1.5 mg/L和NAA0.2 mg/L,芽分化率为63%。在MS+NAA0.2 mg/L的条件下,三种类型的百合鳞茎生长状况最佳,鳞茎平均直径可达1.11 cm;培养30 d后,再生鳞茎数量平均达到70个以上。2、建立了百合遗传转化体系利用无缝克隆技术构建了 pRI101-AGPase超表达载体,采用农杆菌介导的方法对铁炮型百合‘萨利’的愈伤组织和分化的鳞片组织进行遗传转化。结果表明,百合鳞片组织更适宜进行遗传转化,愈伤组织侵染后易褐变致死;愈伤组织卡那霉素最佳的筛选浓度为75 mg/L,小鳞片最适筛选浓度为100 mg/L。以农杆菌EHA105为侵染菌株,OD600值为0.8时,GUS染色率最高;侵染时间为10 min的条件下,再生芽及GUS染色率均较高,且染色效果较好。通过PCR分析,成功检测到GUS条带,确定载体已成功导入‘萨利’基因组中,进一步的GUS鉴定表明成功获得了阳性植株;阳性株通过荧光定量PCR(qRT-PCR)分析,表明AGPase基因的表达量高于野生型的百合组培苗,稳定转化率达10.83%。3、构建了百合AGPase基因编辑载体根据AGPase基因序列设计sgRNA,并合成相应序列,以pRGEB32载体为模板,构建AGPase基因编辑载体。试验中,利用CRISPR-P设计了 GC含量为60%的sgRNA序列,与pRGEB32载体连接,通过测序,在载体序列中检测到sgRNA保守序列,验证了载体的完整性。以AGPase为靶基因的遗传转化试验获得正常的遗传转化株25个,对其中10个进行PCR检测得到10个阳性转化株,提取植株DNA进行测序,分析表明,未获得靶序列敲除植株突变位点。后期为获得足够的转化苗,设计多个靶位点,进行再次转化及敲除植株检测。
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