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本研究以CbCOR15a基因为目的基因,eGFP为报告基因,构建由玉米泛素启动子Ubi调控的适合水稻和甘蔗遗传转化的转基因植物表达载体,利用基因枪法轰击洋葱表皮细胞进行瞬时表达研究发现,Ubi能够成功调控下游的目的基因eGFP表达。本研究初步建立了适合籼稻品种桂649R、187R、天B、明恢63、916S、粳型亲籼系常规稻华粳籼74和甘蔗品种ROC22的转化体系,为后续转基因植株获得及鉴定奠定基础,初步探讨了转基因过程中存在的一些问题。主要研究成果如下:
1、构建了适合外源基因导入籼稻和甘蔗的双元植物表达载体3300-Ubi-CbCOR15a-eGFP,利用基因枪法将目的基因CbCOR15a导入洋葱表皮细胞,通过显微镜技术检测到报告基因eGFP表达后具有强烈的荧光信号,结果表明Ubi启动子能够有效调控下游基因CbCOR15a和eGFP成功表达。
2、对比水稻两种成熟胚和幼穗愈伤组织诱导率。由强到弱依次为:幼穗、新鲜成熟胚、陈年成熟胚,且诱导出幼穗愈伤组织明显优于成熟胚愈伤组织。6个水稻品种诱导率由高到低依次为:华粳籼74>187R>明恢63>916S>桂649R>天B。
3、对比3种分化培养基对水稻成熟胚愈伤组织的分化效果,结果表明添加了3种激素(6-BA,NAA,IAA)的分化效果最好,利用该培养基分化幼穗愈伤组织,分化率最高可达82.98%。
4、利用浓度为2mg/L的2,4-DMS培养基诱导甘蔗ROC22愈伤组织,诱导率最高可达100%,分化培养基能够使甘蔗ROC22愈伤组织分化率最高可达100%,绿苗分蘖力强。
5、农杆菌侵染水稻愈伤组织后,利用300mg/L的Cef(头孢噻肟钠)抑菌培养,水稻愈伤组织全部褐化死亡,200mg/L的Cef或500mg/L的Car(羧苄青霉素)很难抑制农杆菌生长,结果表明Cef应在200mg/L~300mg/L间进行抗生素敏感性实验。
6、农杆菌侵染甘蔗愈伤组织,共培养后在含有250mg/LCef(头孢噻肟钠)的分化培养基上分化,获得株高1cm~5cm的再生植株,转入生根培养基中继续培养。