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微生物通过引入外源脯氨酸-4-羟化酶基因（p4h）,转化游离的L-脯氨酸发酵合成反式-4-羟脯氨酸（HYP）。然而,仅通过菌株自身提供的前体L-脯氨酸无法满足反式-4-羟脯氨酸的稳定合成,外源添加L-脯氨酸虽能一定程度上满足其合成的需求,但成本较高。本文在枯草芽孢杆菌中架构了反式-4-羟脯氨酸生物合成途径,通过对其L-脯氨酸合成途径相关基因功能探究分析,成功提升了细胞自身L-脯氨酸合成能力,为反式-4-羟脯氨酸的高效合成奠定了基础。本文主要研究内容与结果如下:（1）构建了组成型质粒p MA5-P4H和诱导型质粒p HY-Bs.xyl-P4H,分别转入枯草芽孢杆菌WB600中,构建了重组菌WB600/p MA5-P4H和WB600/p HY-Bs.xyl-P4H。重组菌WB600/p MA5-P4H摇瓶发酵48 h反式-4-羟脯氨酸浓度达到24.13 mg·L-1;重组菌WB600/p HY-Bs.xyl-P4H添加终浓度1.5%木糖诱导,摇瓶发酵48 h和96 h分别积累了80.59 mg·L-1和125.51 mg·L-1反式-4-羟脯氨酸。（2）根据枯草芽孢杆菌中以谷氨酸为前体的脯氨酸合成途径,分别构建了代谢改造的重组菌以增强脯氨酸合成及降低谷氨酸代谢分流,并考察不同改造方式对胞内及胞外脯氨酸积累的影响。结果显示,单独表达脯氨酸合成相关基因与单独敲除谷氨酸代谢分流基因均能有效提升细胞内外的脯氨酸积累。基于单基因改造的结果构建了重组菌WB604[Δgln A,gln A::（P43-pro B-Neo）],其胞外脯氨酸含量及单位细胞得率分别是原始菌的7.15和10.41倍,且胞内游离脯氨酸含量是原始菌的4.86倍。进一步研究发现,在5%Na Cl胁迫条件下,实验组菌株胞内游离脯氨酸浓度均较非胁迫时有所上升,达到相对平衡状态。重组菌WB604胞外脯氨酸含量及单位细胞得率分别是原始菌的5.51和7.69倍,其生物量是重组菌WB603（Δgln A,gln A::Neo）的1.26倍。此外,过表达pro B、pro A基因的重组菌WB601和WB602其生物量分别是非胁迫条件时的1.40和2.05倍,表明过表达pro B、pro A基因能增强细胞耐盐性。（3）以遗传改造的重组菌WB604为宿主,构建了产HYP重组菌WB604/p HY-Bs.xyl-P4H。其摇瓶发酵结果显示,初始添加终浓度10 m M谷氨酰胺（Gln）,发酵12 h胞外L-脯氨酸含量为698.54 mg·L-1,单位细胞脯氨酸得率为233.70 mg·g-1 DCW,分别是对照菌WB600/p HY-Bs.xyl-P4H的4.17和4.23倍;发酵96 h重组菌发酵液中积累了143.02mg·L-1反式-4-羟脯氨酸,较不添加Gln时提高了30.41%,而继续增加Gln添加量时发酵液中反式-4-羟脯氨酸浓度无显著变化。与对照菌株在不添加Gln和添加Gln时相比,反式-4-羟脯氨酸含量分别提高了13.95%和31.09%。（4）重组菌WB604/p HY-Bs.xyl-P4H摇瓶发酵的碳源和氮源经初步优化,初始碳源为15 g·L-1葡萄糖,有机氮源比例蛋白胨:酵母粉为1:2时,发酵液中反式-4-羟脯氨酸的浓度可达到448.57 mg·L-1,是未优化前的3.14倍。