论文部分内容阅读
研究背景结肠癌是常见的消化道恶性肿瘤,其发病率和死亡率在全世界恶性肿瘤中排名前三。结肠癌的高死亡率通常与其远处转移有关,肝脏是最常见的转移靶器官,超过50%的患者会发生肝转移。深入探讨结肠癌肝转移的具体机制,有利于开发有效的应对措施,提高治疗效果。肿瘤转移灶能否形成很大程度上取决于靶器官是否有合适的转移前微环境。肝脏转移前微环境的形成主要依赖两个方面:第一是肿瘤原发灶对肝脏原有细胞的功能改造;第二是对非肝脏原有细胞的募集,主要为骨髓来源的细胞。近年发现与肿瘤增殖及转移关系密切的一类细胞被称为“髓源性抑制细胞(MDSCs)”。MDSCs由骨髓造血干细胞分化而来,主要分为单核细胞性髓源抑制细胞(M-MDSCSs)及粒细胞性髓源抑制细胞(PMN-MDSCs)。CXCL1与CXCL2均为趋化因子家族成员,早期研究发现两者作为趋化中性粒细胞的重要因子,通过结合靶细胞上的CXCR2受体发挥作用。而MDSCs主要通过其膜受体CXCR2与配体的结合被趋化。因此,肝脏高表达CXCL1或CXCL2可能是肝脏中PMN-MDSCs含量升高的原因之一。肝星形细胞是肝脏主要的间质细胞,分为静息态和激活态。在正常肝脏中肝星形细胞为静息态,在炎症等刺激因子的作用下,肝星形细胞会转化为激活态。激活的肝星形细胞在肝转移前微环境形成中的研究主要集中在调节细胞外基质转化和促进肿瘤血管生成。目前激活的肝星形细胞在结肠癌肝转移前微环境形成过程中的作用报道较少。本项目着重研究结肠癌中肝星形细胞的激活对PMN-MDSCs募集至肝脏的重要性,并进一步探讨相关机制。研究方案1.研究MDSCs与非转移性结直肠癌的关系收集南方医院30例Ⅰ/Ⅱ/Ⅲ期结直肠癌患者及10例健康志愿者外周血标本,流式细胞术分析比较两组外周血单核细胞中MDSCs及其两种亚群含量的高低。分析TCGA数据库结直肠癌数据,讨论MDSCs浸润与临床预后关系。2.分析结肠癌转移前肝脏中MDSCs的含量构建小鼠原位结肠癌种植瘤模型,对照组予不含细胞的RPMI-1640培养基做局部注射。根据文献报道,于3周后肝脏切片HE染色确定尚未发生肝转移后再次构建原位结肠癌种植瘤小鼠模型,流式细胞术分析实验组及对照组小鼠肝脏及骨髓中PMN-MDSCs及M-MDSCs含量的变化。3.验证肝脏通过CXCL1募集PMN-MDSCs分别予CXCR2抑制剂或等量植物油处理结肠癌原位荷瘤小鼠,3周后流式细胞术分析两组小鼠肝脏中PMN-MDSC含量的变化。采用qPCR检测小鼠原位结肠癌种植瘤3周后肝组织CXCL1、CXCL2表达水平变化。分离小鼠的骨髓细胞,流式分选PMN-MDSCs细胞。Transwell实验观察CXCL1对PMN-MDSCs的趋化能力。4.结肠癌致肝星形细胞活化,肝星形细胞通过CXCL1募集PMN-MDSCs采用组织免疫荧光检测荷瘤小鼠及对照组小鼠肝脏组织中肝星形细胞活化的相关指标α-SMA、Desmin。分离小鼠的肝脏细胞,用结肠癌细胞培养上清刺激24小时后,qPCR及ELISA分析肝系细胞CXCL1在mRNA、蛋白水平表达的变化。将激活与未激活的肝星形细胞与PMN-MDSCs进行间接共培养,Transwell实验观察PMN-MDSCs趋化性的变化。研究结果1.MDSCs高浸润提示结直肠癌患者的预后不良30例Ⅰ/Ⅱ/Ⅲ期结直肠癌患者和10例健康志愿者外周血样本的流式细胞术分析结果显示结直肠癌患者外周血MDSCs及其亚群含量显著高于健康志愿者。分析TCGA结直肠癌数据,结果提示MDSCs浸润高的结直肠癌患者的总生存期明显较短。2.动物实验提示PMN-MDSCs在结肠癌转移前已在肝脏显著浸润;小鼠结肠癌原位种植瘤3周后HE染色确定无肝脏转移。流式细胞术分析发现在小鼠骨髓中,实验组和对照组小鼠中两类MDSCs含量无明显变化,而在荷瘤小鼠中PMN-MDSCs在肝脏显著增加。3.PMN-MDSCs通过CXCL1被募集至肝脏采用CXCR2抑制剂处理结肠癌原位种植的小鼠后肝脏PMN-MDSCs含量较对照组处理的荷瘤小鼠降低。qPCR检测荷瘤小鼠肝组织CXCL1水平较对照组显著增加。Transwell实验显示CXCL1对PMN-MDSCs有趋化作用。4.结肠癌致肝星形细胞活化,肝星形细胞分泌CXCL1募集PMN-MDSCs免疫荧光检测发现结肠荷瘤小鼠转移前肝脏组织α-SMA及Desmin的表达水平升高,表明结肠癌原发灶可激活转移前肝脏的肝星形细胞。分离小鼠的肝脏细胞,用结肠癌细胞培养上清刺激24小时后,qPCR检测发现CXCL1在肝星形细胞中表达最为明显,同时ELISA实验也检测到结肠癌细胞上清刺激肝星形细胞后其CXCL1蛋白水平升高。Transwell实验结果显示肝星形细胞经肠癌细胞培养上清刺激激活后其促PMN-MDSC迁移能力增强。研究结论1.MDSCs高浸润提示结直肠癌患者的预后不良;2.PMN-MDSCs在结肠癌转移前已在肝脏显著浸润;3.结肠癌致肝星形细胞激活,活化的肝星形细胞分泌CXCL1募集PMN-MDSCs至肝脏,参与结肠癌肝转移前微环境的形成。