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苹果酸脱氢酶(malate dehydrogenase,MDH)广泛存在于自然界当中,负责催化苹果酸与草酰乙酸之间的可逆转换,在细胞的多种生理活动中发挥重要作用,如C4循环、光合作用、TCA循环。高等植物中根据辅酶特异性、亚细胞定位以及生物学功能的不同,植物苹果酸脱氢酶可以分为五种类型:叶绿体依赖NADP的MDH(Chloroplast NADP-dependent MDH,chMDH)、线粒体依赖NAD的MDH(Mitochondrial NAD-dependent MDH,mMDH)、微体依赖NAD的MDH(Microbody NAD-dependent MDH)、叶绿体依赖NAD的MDH(Chloroplast NAD-dependent MDH,cnMDH)以及细胞质依赖NAD的MDH(Cytosolic NAD-dependent MDH,cMDH)其中胞质型苹果酸脱氢酶在高等植物中尚未得到广泛研究。利用RT-PCR及cDNA末端快速扩增法,获得了完整的茶树细胞质苹果酸脱氢酶(cMDH)基因Cs-cMDH (GenBank登录号为GQ845406)。该基因全长1235 bp,编码332个氨基酸,分子量约为35.5 kDa。含重组质粒pGEX-MDH的E. coli Rosetta经0.5 mM IPTG于32℃诱导3 h后可以获得大量可溶性的61.5 kDa融合蛋白。NCBI的BLAST结果显示,Cs-cMDH与高等植物cMDH的氨基酸序列一致性高达88~93%。通过基于蛋白质结构的多序列比对,预测Cs-cMDH为二聚体,每个亚基包含13个β-折叠及13个α-螺旋。Cs-cMDH包含典型的MDH“指纹”(fingerprint)序列G12AAGQIG18,其氨基酸残基D43在所有NAD-MDH中都很保守。Cs-cMDH还包含一些与其它NAD-MDHs同源的保守序列单元,如NAD+结合位点、催化模体及底物结合位点。而且Cs-cMDH还包含在所有植物NAD-cMDHs中都相当保守的6个Cys。因此我们推断Cs-cMDH为茶树细胞质NAD-MDH。茶树基础代谢相关基因cMDH的克隆和原核表达为Cs-cMDH的功能研究奠定了基础。以Streptomyces lividans TK54基因组DNA为模板扩增出苹果酸脱氢酶基因(GenBank登录号为EU715400),包含一个990bp的开放阅读框。序列同源性分析表明S. lividans TK54的MDH(SlMDH)与其他物种的细胞质MDH有较高的同源性。将SlMDH基因克隆入pET-28(b)表达系统,实现了其在大肠杆菌中的异源表达。蛋白质凝胶电泳分析显示重组蛋白的分子量约为35.5 kDa。对纯化后的MDH酶学性质进行了初步研究,结果显示重组蛋白SlMDH的最适反应温度为45℃,最适反应pH为8.0。重组蛋白对辅酶NADH和底物草酰乙酸的动力学常数Km分别为26.0μM和79.3μM,kcat分别为1850 s-1和3280 s-1。此外,该重组蛋白对草酰乙酸无底物抑制性,金属离子对它的影响也不明显。