鲍鱼中类胰凝乳蛋白酶基因克隆及蛋白酶活测定

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鲍属软体动物门、腹足纲(Gastropoda)、鲍科(Haliotidae)、鲍属(Haliotis),属于珍稀海味食品。鲍养殖业发展初期病害较少,发病率和死亡率都很低,但养殖2~3年后就会出现不同程度的死亡,且越来越严重;病害导致许多养鲍场严重亏损甚至倒闭,严重影响养鲍产业的发展。与此同时,鲍苗掉板危害对我国鲍鱼养殖业发展也带来极大的负面影响。 鲍病害主要由各种病原微生物引起,包括病毒、细菌、寄生虫、真菌和支原体等生物性病原,这些病原引起鲍鱼病害后,由于鲍鱼自身免疫应激反应,会引起鲍鱼体内一些酶或蛋白的变化,而导致蛋白质差异变化可能发生在由鲍鱼体内相关基因转录成mRNA过程,也可能发生在mRNA翻译成蛋白产物的过程或蛋白质产物修饰过程。因此,研究病鲍与健康鲍基因转录mRNA的差异是很有意义的工作,或许能够发现引起鲍病害发生的原因,从而为科学养殖鲍鱼、解决鲍病害的困扰提供依据,食品行业提供优质、珍贵的鲍鱼食品原料。 抑制差减杂交技术(suppression subtraction hybridization,SSH)是利用杂交和聚合酶链式反应(PCR)技术比较两个不同来源的样本mRNA差异。而通过快速扩增cDNA末端(Rapid Amplification of cDNA Ends,RACE)技术能够得到一个已知部分序列的基因片段全长。在本论文中,利用SSH技术比较病鲍和健康鲍mRNA的差异。首先将两个样本的mRNA提取出来,反转录成cDNA,经过酶切、连接接头等处理,使病鲍cDNA形成Tester,健康鲍的cDNA形成Driver。接着,Tester和Driver两个cDNA样本经过杂交比较,抑制PCR扩增,就得到在两样本中有差异表达的cDNA,建立差异表达cDNA基因片段文库。文库中的基因片段表示在病鲍中表达,而在健康鲍中不表达或表达量极小的基因片段。GenBank中比对这些序列,通过5'、3'RACE得到认为有研究价值的基因片段的全长,通过进一步的研究,找出鲍病害与差异表达基因之间的关系。 通过本论文的研究实验,建立了病鲍和健康鲍差异表达cDNA基因片段文库,并对文库中一条与胰凝乳蛋白酶相似性为52.8%的chym full基因片段进行研究,通过RACE技术得到chym full基因全长为931个碱基。用Vector NTI软件分析,结果显示:chym full基因序列的读码框编码一条255个氨基酸残基的肽链,肽链序列与几种不同来源的胰凝乳蛋白酶的肽链序列相似性高达87.3%,氨基酸残基相同率为14.1%,构成活性部位的组氨酸(H)、天冬氨酸(D)和丝氨酸(S)三个氨基酸也与其它来源的胰凝乳蛋白酶相同,同时具有胰凝乳蛋白酶中2~3对保守的半胱氨酸残基的特点,因此,该基因表达产物与胰凝乳蛋白酶极为相似,本论文中称其为类胰凝乳蛋白酶,该酶前19个残基为信号肽,在酶原激活时被切 除。另外,本论文也涉及对鲍鱼受精卵发育变态过程各时期的蛋白酶酶活和mRNA基因水平变化的初步研究,结果显示蛋白酶酶活在变态发育后期上升约50%,而凝胶电泳图上显示其mRNA基因水平在整个变态发育期变化不大。
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