论文部分内容阅读
研究背景：结肠癌是世界上致死率较高的癌症之一，对人类的健康生活有着非常恶劣的影响。据统计，在西方发达国家中，结肠癌死亡率居第二位，在我国，死亡率居第五位。结肠癌的发病过程是一个多阶段干涉、多基因参与和影响的病理过程。AP-2为转录因子活化蛋白Ap-2家族一员，作为一种抑癌基因参与着多种肿瘤的形成、迁徙及转移。端粒酶催化亚基即端粒酶逆转录酶（hTERT）作为端粒酶的核心，在肿瘤细胞中高度表达，但在正常细胞中表达活性较低，端粒酶的激活是肿瘤形成的特异性标识。因此，在肠道肿瘤分子领域，寻找一种新型预防治疗手段已成为该领域的一项重要课题。目的：1、观察干扰Ap-2表达对HCT116细胞增殖的影响2、研究结肠癌细胞中转录因子Ap-2对hTERT的调控作用。3、研究转染Ap-2表达对SW480端粒酶活性的影响。4、初步探讨并研究转录因子AP-2抑制hTERT表达的作用机制方法：1、采用琼脂糖凝胶电泳法以及DNA测序法鉴定真核表达质粒pcDNA3.1(+)-AP-22、利用脂质体介导转染真核表达质粒pcDNA3.1(+)-AP-2及GV102-AP-2-RNAi。3、采用Western blot印迹法和RT-PCR法检测转染48h后AP-2及hTERT、Sp1表达水平；4、用MTT法研究转染GV102-AP-2-RNAi干扰质粒24、48、72、96h后HCT116细胞增殖情况；5、TRAP-PCR银染法检测SW480中转染pcDNA3.1(+)-AP-2前后端粒酶活性。结果：1、酶切鉴定法及DNA结构测序均证明pcDNA3.1(+)-Ap-2真核表达质粒为所需要的目的质粒。2、MTT结果提示转染Ap-2-siRNA后，HCT116细胞增殖加快，48、72、96H的增殖率分别为27.1%、36.4%、42.1%3、转染pcDNA3.1(+)-AP-2至SW480细胞后，Ap-2mRNA及蛋白水平均显著升高；hTERT mRNA及蛋白水平均均明显下降，与转染前相比分别下降了40.14%及36.52%。；4、转染GV102-AP-2-RNAi至HCT116后，Ap-2mRNA含量降低；hTERTmRNA含量升高，与转染前相比升高了1.92倍。5、银染法示SW480转染Ap-2基因后特征性条带变得不明显，端粒酶活性降低。6、转染pcDNA3.1(+)-AP-2至SW480细胞后，Sp1蛋白表达水平与之前相比降低了34%；转染GV102-AP-2-RNAi至HCT116后，Sp1蛋白表达水平升高了1.24倍。结论：AP-2对结肠癌细胞HCT116的增殖起到了抑制作用，具体的作用机制可能是通过减少SP-1表达进而降低hTERT的表达水平，从而发挥抑制结肠癌细胞增殖的作用。AP-2作为一种抑癌基因在本实验中也得到证实，为下一步结肠癌的基因治疗提供了实验室理论依据。