谷氨酸棒杆菌中共表达短乳杆菌来源的谷氨酸脱羧酶生产γ-氨基丁酸

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γ-氨基丁酸(Gamma-aminobutyric acid,简称GABA)是由谷氨酸脱羧酶(Glutamatedecarboxylase,简称GAD)催化L-谷氨酸发生不可逆的α-脱羧反应生成的,具有多种生理功能,被广泛应用于食品、医药和农业等行业。实验室前期研究了一种简单经济的GABA生产方式,即在谷氨酸棒杆菌中表达短乳杆菌Lb85来源的一个谷氨酸脱羧酶基因,能直接将自身合成的L-谷氨酸转变成GABA,但是产量比较低。因此,本研究是在前期工作的基础上构建了一株谷氨酸棒杆菌工程菌,将短乳杆菌Lb85来源的两个谷氨酸脱羧酶基因gadB1、gadB2进行共表达,通过发酵优化显著提高了GABA的产量。主要研究内容和结果如下:(1)首先分别构建了gadB1和gadB2单基因表达菌ATCC13032/pDXW-10-gadB1、ATCC13032/pDXW-10-gadB2和二者共表达的工程菌ATCC13032/pDXW-10-gadB1-gadB2;然后将三株工程菌进行初步发酵比较GABA合成能力,发现ATCC13032/pDXW-10-gadB1-gadB2GABA合成能力(4.02g/L)明显高于另外两株,因此确定以ATCC13032/pDXW-10-gadB1-gadB2为主进行发酵优化。(2)正交试验优化种子培养基,得到最佳种子培养基配方(g/L):葡萄糖25,玉米浆30,尿素8,K2HPO43H2O1,MgSO40.2,培养8h转接发酵。单因素实验优化发酵培养基,确定葡萄糖和玉米浆浓度分别为100g/L和4g/L,在发酵前期10h-24h每隔3.5h补加2.4g/L尿素,并于10h补加0.1mM5’-磷酸吡哆醛(简称PLP),最终GABA的产量达到19.64±3.77g/L,此时L-谷氨酸的转化率为0.69mol/mol。(3)在发酵优化后,研究了ATCC13032/pDXW-10-gadB1-gadB2发酵过程各个参数的变化,结果显示:整个发酵过程GAD一直具有活性,使得胞内GABA持续积累,而且GABA的分泌和L-谷氨酸的消耗引起胞外pH的变化,在此基础上进行了一个延时至120h的发酵,最终GABA产量达到27.13±0.54g/L,L-谷氨酸的转化率达到0.74mol/mol。(4)最后,将ATCC13032/pDXW-10-gadB1-gadB2在3L罐上进行发酵,发酵72h后GABA产量达到26g/L,L-谷氨酸的转化率达0.6mol/mol,相对于摇瓶发酵GABA生产强度有所提高。
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