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背景和目的先天性纯红细胞再生障碍性贫血（Diamond-Blackfan Anemia,DBA）是第一个被鉴定的人类核糖体病,以祖细胞期红细胞生成受阻为主要特征。DBA主要是常染色体显性遗传,由编码大或小亚基核糖体蛋白（Ribosomal Protein,RP）的基因突变或缺失引起。RP基因的突变或缺失会导致RP单倍体不足进而导致核糖体生物合成缺陷,而RP单倍体不足是导致DBA发生的主要原因。DBA在基因型和表型上都是异质的,单个基因拷贝的改变就足以引起该疾病,因此DBA相关的每个基因都应该深入研究。尽管目前对DBA的机制有了一定的了解,但是众多RP基因是否都会在红细胞分化过程中起到关键作用还有待研究。本研究前期发现一名患者,其临床症状与DBA相符;对其血液标本进行全基因组测序后发现其核糖体大亚基蛋白3（Ribosomal Protein L3,RPL3）基因突变。RPL3基因编码RPL3,而RPL3不仅是核糖体60s大亚基的一个组成部分,还是核糖体肽基转移酶活性所需的重要组成部分。此外,RPL3还作为游离蛋白,直接参与细胞生命相关的各种核糖体外功能。因此,本实验通过对RPL3的研究,初步探究其在体外红系分化中的作用。方法为了研究RPL3缺陷在体外红系分化过程中的功能影响,本研究通过CRISPR-Cas9技术降低RPL3蛋白在细胞中的表达,来观察其对细胞多种功能的影响。为此,本研究进行了如下实验。1.首先设计了针对RPL3 c DNA序列的多个guide RNA（g RNA）,并构建了同时转录g RNA和表达Cas9的慢病毒载体,通过慢病毒侵染UT-7细胞,经单克隆筛选和基因测序验证挑选出切割效率最高的g RNA用于细胞系的构建。2.用最高效率的g RNA构建的载体进行慢病毒包装,然后侵染K562细胞,同样进行嘌呤霉素（puromycin,puro）筛选和单克隆筛选。然后通过Western blotting（WB）从蛋白水平验证单克隆筛选后得到的K562和UT-7细胞中RPL3的敲除效率,选出最高效率的RPL3表达降低的UT-7和K562细胞系用于后续功能验证。3.分别用氯化高铁血红素（Hemin）和促红细胞生成素（EPO）诱导所筛选的K562和UT-7细胞向红系分化。在连续诱导分化的12天里,用直接计数法检测细胞的增殖,流式抗体（CD36-APC,GPA-PE,CD37-APC）检测体外红系分化进程,同时使用流式抗体（Annexin V-FITC/PI）检测细胞凋亡。4.连续诱导的第11天,用PI检测细胞周期,并通过q PCR从RNA水平检测p53及相关基因（p21,Bax,Noxa）的表达情况。结果1.利用CRISPR-Cas9技术的原理,在Zlab网站设计了5个针对RPL3c DNA序列的g RNA（分别命名为g RNA-1、g RNA-2、g RNA-3、g RNA-4和g RNA-5）,用于构建同时转录g RNA和表达Cas9蛋白的慢病毒载体。在构建载体过程中,经基因测序发现g RNA-5载体序列存在碱基缺失。用余下4个慢病毒载体侵染UT-7细胞,然后使用0.5μg/m L puro进行筛选,发现转录g RNA-4的慢病毒侵染的细胞在puro处理中也无法存活。2.将puro筛选过的3种g RNA对应的慢病毒侵染的UT-7细胞（分别命名为g-1、g-2和g-3）提细胞基因组PCR后进行基因测序,在所设计的g RNA切割序列后出现重叠峰,确定初步筛选成功。再通过单克隆筛选分别挑选出g-1、g-2、g-3细胞继续培养,基因测序检测g RNA序列处出现碱基缺失或替换情况,发现:g-1单克隆细胞中阳性率为93.75%,g-2单克隆细胞中阳性率为6.25%,g-3单克隆细胞中阳性率为5.77%,由此可得g RNA-1是五个g RNA中切割效率最高的g RNA。3.将转录g RNA-1的慢病毒侵染K562细胞,同样经1.0μg/m L puro筛选和单克隆筛选。之后通过WB验证得到了最高效率的RPL3表达降低的K562细胞系（即K15）和UT-7细胞系（即g-1 14）。4.在构建好的细胞系中进行体外红系分化和相关功能检测实验。连续诱导细胞向红系分化过程中,检测到细胞红系分化较对照组略有延迟;RPL3表达降低后细胞增殖能力明显低于对照组,尤其从第四天起对比更明显;细胞凋亡百分比多于对照组,差异略小。5.诱导细胞向红系分化第11天,发现细胞周期受到阻滞,阻滞在S期;p53表达水平降低,而p21,Bax,Noxa表达水平在K562细胞中略微升高,在UT-7细胞中明显下降。结论本研究利用CRISPR-Cas9系统筛选出能够高效敲除RPL3表达的g RNA（即g RNA-1）并构建了同时转录g RNA-1和表达Cas9蛋白的慢病毒载体,通过同时在慢病毒上表达的puro抗性基因筛选了RPL3表达降低的K562和UT-7细胞系。在体外定向红系分化过程中,发现RPL3表达降低导致所筛选的两种细胞均红系分化延迟,细胞增殖受到抑制,细胞凋亡略有增加,细胞周期S期受到阻滞。这说明RPL3缺失对红系分化造成了影响。本研究还发现,在体外红系分化过程中RPL3表达降低导致p53表达水平下降。这表明RPL3可能通过不依赖p53的机制造成细胞功能异常,也间接存在RPL3缺失更易诱发癌症的可能,这也是本课题后续研究的方面之一。