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哺乳动物雷帕霉素受体蛋白(Mammalian Target Of Rapamycin，mTOR)是一种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，它参与了调节细胞生长，增殖，自噬等一系列生物学的过程。有研究报道，rapamycin处理细胞的时间长短所产生的生物学效应存在差异。尽管mTOR的经典功用在于调节细胞核内的转录活性，但是短时间内rapamycin影响细胞核行为的分子机制尚不清楚。本研究试图从蛋白质组分析着手，测定TSC2(Tuberous sclerosis complex2)敲除的小鼠胚胎成纤维细胞(mouse embryonic fibroblasts，MEF)经rapamycin处理后，在不同时间点上的细胞核差异蛋白质组，进而探索rapamycin短时间处理在细胞核中所引发的分子事件。 我们首先考察了rapamycin短时间和长时间处理TSC2-/-MEF细胞后，mTORC1通路的变化;发现rapamycin与该细胞孵育1小时后即可抑制mTORC1下游S6蛋白的磷酸化;而延长孵育至24小时，则大量的mTORC1调控的下游基因呈明显的丰度变化。因此，在本实验中我们选择rapamycin孵育TSC2-/-MEF细胞1和24小时为典型的短时间和长时间处理，然后系统地分析两种处理条件下细胞核内蛋白质组的定量变化。我们采用了差速离心和蔗糖密度梯度离心技术，从细胞中分离出高纯度细胞核;我们优化了双向高效液相色谱法分离细胞核蛋白质经胰蛋白酶消化所产生的肽段分离技术;我们建立了iTRAQ标记肽段和定量分析标记肽段的统计计算方法。利用这些关键技术，我们能够较为全面而准确地鉴定TSC2-/-MEF细胞核对rapamycin短时间或长时间处理所产生的定量蛋白质组响应。 与对照组细胞相比，rapamycin处理1小时后TSC2-/-MEF细胞核中47个蛋白质发生了显著变化，且大部分蛋白质的丰度下降，只有6个蛋白质丰度上升;在rapamycin处理24小时后细胞核内有32个差异蛋白质，丰度上升和下降的几乎相等（14个蛋白质上升，18个蛋白质下降）;而短时间和长时间rapamycin处理所共享的蛋白质仅为6个，并且其丰度变化的趋势也未见完全相同。这充分提示，短时间抑制和长时间抑制mTORC1引发的细胞核蛋白质变化可能遵循不同的分子机制。在rapamycin短时间处理的细胞核中，大约75％的差异蛋白质的功能与转录调控相关，而且这些蛋白质均呈丰度下降趋势;在rapamycin长时间处理的细胞核中，大部分差异蛋白质的功能则与细胞骨架、代谢通路、DNA复制及损伤修复等相关。当稳态生物体系受到扰动时，其应激反应即刻启动;但是一般认为，在哺乳类细胞中从转录应激过渡到翻译应激需要几个小时以上的时间。那么，为什么rapamycin短时间处理能够引发细胞核蛋白质丰度发生如此显著的改变呢？核糖体上合成的蛋白质需通过核孔选择性运输定位于细胞核，此过程依赖于细胞核质转运受体—输入蛋白(Importins)和输出蛋白(Exportins)。我们采用Western Blot方法分别测定了rapamycin处理前后细胞核中质谱检测到的核质转运相关蛋白。在rapamycin处理后1小时，输入蛋白importinα2和importinβ1在细胞核中呈下降趋势，而输出蛋白exportin1则没有显著变化。这提示rapamycin处理可能引起核质转运平衡的受阻。我们也利用pan泛素修饰抗体检测核内蛋白质的泛素化水平，观察到rapamycin处理1小时后的细胞核蛋白质的整体泛素化水平升高，这意味着核蛋白质的降解可能被激活。综合蛋白质组和免疫印迹的实验数据，我们假设rapamycin短时间处理TSC2-/-MEF细胞可抑制胞浆蛋白质入核，并活化核蛋白质的降解，二者可能是导致rapamycin处理后核蛋白质丰度显著下降的主要原因。