松材线虫病(Bursaphelenchus xylophilus)是我国目前最严重的森林灾害,其致病机理研究的滞后和已有研究结果的争议,严重制约了松材线虫病的基础研究进展和有效防控技术的产出。松材线虫侵入松树后,引起松树蒎烯类物质代谢紊乱,松树树脂道内蒎烯类物质大量积累,从而诱导松树空洞化现象的产生,最后导致松树因缺水而死亡。松材线虫在寄主体内必须面对蒎烯等次级代谢产物的胁迫,松材线虫对松树次级代谢产物的分解代谢过程,是松材线虫成功定殖和大量繁殖的必要条件,也是松材线虫的致病过程。细胞色素P450(CYP450)基因及其调控途径可能是松材线虫应对蒎烯类物质胁迫过程中的重要基因之一。为了研究CYP450基因在松材线虫致病过程中的作用,我们开展了以下研究:1)通过气相色谱法和实时定量PCR检测松材线虫接种寄主松树后,一个月内松树主要蒎烯类物质代谢和松材线虫CYP450基因表达模式之间的相关性,从而探究松材线虫应对寄主蒎烯类物质胁迫时的关键细胞色素P450基因的作用。研究发现松材线虫接种马尾松后,松树蒎烯合成酶基因分别在第6天和第21天上调表达,而寄主松树体内α-蒎烯和β-蒎烯的含量也具有两个峰值,分别在第9天和第27天时最高。同时,松材线虫CYP33C9基因在接种后第12天和第15天大量表达,CYP33C4基因在第21天表达量最高。松材线虫的入侵引起松树蒎烯合成酶基因上调表达,生物合成大量蒎烯类物质,松材线虫CYP450基因响应松树蒎烯类物质的大量积累而上调表达。因此,松材线虫CYP33C9和CYP33C4基因可能参与了松材线虫蒎烯类物质代谢过程,是松材线虫致病相关基因之一。2)通过RT-PCR基因克隆方法克隆了松材线虫CYP33C9和CYP33C4基因,与GenBank上松材线虫全基因组同源性均为100%,其中CYP33C9基因为1504bp,而CYP33C4基因1506bp。生物信息学分析发现CYP33C9和CYP33C4基因均具有转移酶活性,同时CYP33C4基因还具有氧化还原酶活性。另外,构建了松材线虫CYP33C9和CYP33C4基因RNAi载体,体外合成其dsRNA,通过ds RNA溶液浸泡后,成功干扰了松材线虫CYP33C9和CYP33C4基因表达。3)通过RNAi技术沉默松材线虫CYP33C9和CYP33C4基因后,寄主松树蒎烯合成酶基因分别在第3d和第3、9、12d大量表达,α-蒎烯和β-蒎烯分别在第6d和第15d含量最高。而未经RNAi处理后的松材线虫接种后,松树体内蒎烯合成酶基因在第6d和第21d大量表达,α-蒎烯和β-蒎烯分别在第9d和第27d时含量最高。松材线虫CYP33C9和CYP33C4基因沉默后松树体蒎烯类物质次级代谢时间提前,且不存在第二次蒎烯类物质的积累。因此,松材线虫CYP450基因的沉默会影响寄主蒎烯类物质代谢,这类基因在松材线虫与寄主互作中有重要作用。4)CYP33C9基因和CYP33C4基因沉默后,松材线虫在松树体内种群数量较小,繁殖率降低。RNAi松材线虫接种松树后,松树针叶萎蔫下垂,但针叶为绿色,树干失水,植株濒临死亡,而未沉默CYP450基因的寄主松树针叶萎蔫变黄脱落,树干干枯,植株死亡。松材线虫CYP33C9基因和CYP33C4基因沉默后,松材线虫繁殖率和致病性降低。因此,CYP33C9和CYP33C4基因与松材线虫繁殖率致病性相关,是松材线虫致病过程中的重要致病基因。5)低浓度α-蒎烯处理条件下,松材线虫繁殖率降低,雌雄比较小且稳定在较低水平;而高浓度α-蒎烯处理条件下,松材线虫繁殖率较高,雌雄比增大;α-蒎烯和β-蒎烯混合处理条件下,松材线虫繁殖率最低,雌雄比最小。总之,松树主要次级代谢产物会影响松材线虫繁殖率,而松材线虫在适宜环境条件下产生大量雌性后代,不适宜环境条件下产生较多的雄性后代,松材线虫通过雌雄比调解种群繁殖率,从而控制种群数量来适应环境变化。6)通过RNAi技术沉默松材线虫CYP33C9和CYP33C4基因后,与未RNAi处理的对照组相比,松材线虫繁殖率降低,雌雄比变小。在不同浓度α-蒎烯和以及与β-蒎烯混合处理条件下,松材线虫CYP33C9和CYP33C4基因RNAi后松材线虫种群数量降低,雌雄比变小,繁殖率降低。因此,CYP33C9和CYP33C4基因RNAi后,松材线虫对蒎烯类物质胁迫的适应性降低,这两个基因可能参与了松材线虫对蒎烯类物质解毒代谢过程,是松材线虫致病过程中的解毒基因之一。综上所述,CYP33C9和CYP33C4基因与松材线虫蒎烯类物质代谢相关,能提高松材线虫在寄主体内的适应性,从而增强松材线虫繁殖率和致病性,是松材线虫致病过程中的重要关键致病基因之一。