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上皮细胞是宿主与细菌相互接触的前沿，除了物理屏障功能，上皮细胞通过产生细胞因子、化学因子、抗菌多肽等而成为宿主防御病原体感染的第一道防线。肺炎克雷伯杆菌（Klebsiella pneumoniae，KP）是一种重要的条件致病菌，当机体免疫力低下时，能引起疾病的发生。从尿路到呼吸道，KP感染的发病率都很高，且在临床上易反复发作。KP感染上皮细胞的过程可分为识别、粘附、侵袭，当细菌与上皮细胞粘附时，启动了上皮细胞的信号转导系统，细胞开始对粘附的细菌内吞。与KP致病的相关因子，主要为荚膜抗原、粘附素如1型菌毛、LPS、抗血清反应系统以及铁载体。机体的天然免疫通过模式识别受体（Patten recognition receptor，PRR）识别病原相关分子模式（Pathogen associated molecular pattens，PAMP），诱导机体产生炎症反应和免疫应答。TLR就是一类进化保守的胚系编码的PRR，TLR4主要识别革兰氏阴性菌的LPS。上皮细胞有复杂的免疫防御及炎症反应机制，涉及一系列炎症信号转导和基因表达及调控机制。致病菌与上皮细胞长期接触，形成了复杂的入侵与抗感染机制。一方面，细菌通过致病因子，包括粘附因子、侵袭因子、毒力因子入侵机体进行繁殖、扩增，导致疾病的发生。另一方面，宿主通过自身的防御机制，抵抗致病菌的入侵。上皮细胞不但能够产生具有直接杀灭病原微生物的抗菌肽分子，还能够产生调节免疫和炎症反应的细胞因子、趋化细胞因子，进一步激活其他炎症和免疫细胞。本研究的目的是通过细胞实验模型，用两株临床分离的肺炎克雷伯杆菌（K5、03183），与膀胱移型上皮细胞T24共同作用，观察KP在T24细胞内的动态变化。分别在不同的时间点用TritonX-100裂解细胞，释放细胞内的活菌，用平板菌落计数法，计数细胞内的活菌数。结果表明，K5、03183在膀胱上皮细胞T24细胞内有一定的生长趋势，在48小时之后，细胞内活菌数开始减少。说明膀胱上皮细胞有一定防御能力，可以清除细胞内的KP。TNF-α、INF-γ、IL-1β是炎症细胞因子，也是调节天然免疫的重要介质。用K5、03183感染T24细胞，再加入TNF-α和INF-γ与细胞作用，分别于细菌感染后的4小时、24小时裂解细胞，释放出细胞内的活细菌，用平板菌落计数法，计数胞内活菌数。结果发现，TNF-α和INF-γ联合作用能够显著促进T24细胞清除胞内的KP。而TNF-α与INF-γ共同作用于K5感染的T24细胞，分别于细菌感染后的4小时、12小时、24小时、48小时裂解细胞，细胞因子组在24小时开始减少。单独使用不同浓度的TNF-α、INF-γ或IL-1β（5、10、20ng／ml），分别于细菌感染后的4小时、24小时、48小时裂解细胞，结果发现，INF-γ促进T24细胞清除胞内KP的能力较TNF-α、IL-1β强。联合使用INF-γ与IL-1β，或者联合使用INF-γ加TNF-α，分别于K5感染T24后的4小时、24小时、48小时裂解细胞，结果显示INF-γ加IL-1β组促进T24细胞清除胞内KP的能力不如INF-γ加TNF-α组。吞噬细胞（比如中性粒细胞）在炎症反应时发生“呼吸爆发”（respiratory brust），产生大量活性氧簇（Reactive oxygen species，ROS）。ROS包括O2-，·OH，NO等自由基物质和H2O2，ONOO-，单线态氧（1O2）等非自由基物质，有很强的杀菌作用。T24细胞的杀菌机制是否与细胞内的活性氧（ROS）和活性氮（RNI）升高有关?实验分别使用过氧化氢酶（CATA）及一氧化氮合酶抑制剂（L-NAME），探讨活性氧和活性氮是否与TNF-α和INF-γ刺激的膀胱上皮细胞抗菌作用相关。结果表明，使用过氧化氢酶（CATA）、L-NAME，细胞内K5、03183的活菌数分别在4小时、24小时明显增加，可见清除了细胞内的H2O2以及NO，T24细胞杀菌能力下降。表明H2O2及NO是T24细胞抗菌作用的重要效应分子。本课题研究结果表明，膀胱上皮细胞对进入胞内的KP有天然抵御能力，通过细胞产生活性氧及NO抑制细菌在胞内生长，TNF-α、INF-γ、IL-1β作为重要的细胞因子，可以增强上皮细胞的抗菌功能。