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对大肠杆菌等平台生物的代谢途径进行改造,积累有用代谢产物是现代发酵工程和合成生物学的核心内容。启动子是基因调控和代谢途径改造的重要调控元件,通过改变启动子的启动活性可以调控目的基因的转录水平以积累代谢产物。本实验室的前期工作用鸟枪法从小球藻病毒基因组随机片段中筛选到一组小球藻病毒强启动子N63,N37,N40;利用RT-qPCR检测了这些启动子控制下的报告基因转录文本丰度,用RACE-PCR确定了转录起始位点,推测了-10区和-35区核心结构,并对这些启动子进行截短等突变。通过PCR等分子生物学技术将各突变启动子连接于启动子探测质粒pKK232-8上,使其可以表达氯霉素乙酰转移酶基因cat。之后将携带各小球藻病毒来源强启动子重组质粒转化菌株培养于含有450μg/mL的LB培养基中进行生长曲线测定来间接分析上述启动子的转录调控活性。本研究从大肠杆菌基因组扩增lacZ基因并与经密码子优化的egfp基因通过Overlap PCR融合,两者之间插入氯霉素乙酰转移酶基因cat的RBS序列,构建由已知细菌强启动子tac或从生长曲线实验中挑选的小球藻病毒强启动子控制的人工操纵子,替代启动子探测质粒pKK232-8的报告基因cat,获得新型双报告基因启动子探测质粒,用于对小球藻病毒来源启动子活性检测。分别利用激光共聚焦显微镜和流式细胞仪对报告基因egfp进行定性和定量分析;以2-硝基苯基-β-D-吡喃半乳糖苷(ONPG)为反应底物,通过测定其产物2-硝基苯酚(ONP)对lacZ基因进行比活力测定。上述质粒转化的E.coli DH5α菌株在激光共聚焦显微镜下呈现绿色荧光,并用流式细胞仪进行了荧光强度的定量测定;转化菌株在含有X-β-Gal的平板上呈现蓝色细胞;细胞裂解液可与无色的ONPG反应成黄色的ONP,这一反应可用于酶活性分析。实验结果表明两个报告基因均能在大肠杆菌中正确表达;通过对lacZ和egfp双报告基因的定量分析和转录水平分析确定了小球藻病毒强启动子的启动活性均强于tac启动子。从双报告基因质粒扩增lacZ-egfp与pKK232-8质粒上原有的cat基因通过overlap PCR融合,两者之间插入氯霉素乙酰转移酶基因cat的RBS序列,构建由已知细菌强启动子tac或从生长曲线实验中挑选的小球藻病毒强启动子控制的人工操纵子,获得三报告基因启动子探测质粒,将其应用于小球藻病毒或环境病毒组样品强启动子的筛选。通过此质粒筛选到的强启动子可直接利用报告基因lacZ和egfp进行转录调控活性的原位检测,提高启动子的筛选与分析效率。由启动子N37,N40,N63及其突变体分别控制单报告基因/选择标记基因cat与三报告基因lacZ-egfp-cat构建的重组质粒转化大肠杆菌E.coli DH5α,对比它们在含有450μg/mL氯霉素的LB培养基中的生长曲线,表明位于三报告基因操纵子远端的cat在多数重组质粒中能正常表达,证明了此策略的可行性;这一系统也可以用于研究启动子对于串联表达系统中相对远端基因的启动活性。本研究进一步将小球藻病毒来源的强启动子应用于大肠杆菌苏氨酸生物合成途径中关键基因/操纵子thrABC内源启动子的替换,以期增加苏氨酸的积累。应用CRISPR/Cas9技术,将苏氨酸生物合成途径中的苏氨酸启动子及其前导链敲除,将小球藻病毒强启动子及氯霉素乙酰转移酶基因cat的RBS序列敲入。构建工程菌E.coli K-12 MG1655ΔilvAΔmetAΔlysAΔtdhΔtdcC::rhtcΔthrLΔthrLp/ptac,E.coli K-12 MG1655ΔilvAΔmetAΔlysAΔtdhΔtdcC::rhtcΔthrLΔthrLp/pN63和E.coli K-12 MG1655ΔilvAΔmetAΔlysAΔtdhΔtdcC::rhtcΔthrLΔthrLp/pN37。其中敲入N37启动子的菌株摇瓶发酵的苏氨酸产量从工程菌的12.88g/L提高到32.32g/L。