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钙霉素（A23187）是由Streptomyces chartreusis NRRL 3882产生的吡咯环类抗生素,在生物化学和药理学研究领域发挥了重要作用。作为天然的二价阳离子载体,钙霉素被广泛应用于钙离子偶联相关的生化途径的研究。此外,钙霉素对结核分枝杆菌有一定抑制作用,与β-内酰胺类抗生素联合使用,用于治疗肺结核病。最新研究表明,钙霉素能够限制结肠癌细胞的转移。对钙霉素的生物合成机理展开深入研究,能够改良钙霉素的结构,从而降低钙霉素对哺乳动物细胞毒性和副作用,将扩大钙霉素的临床应用范围和商业价值。CalA3（180 kDa）是钙霉素生物合成途径中的聚酮合酶,主要含有4个结构域:酮合成酶、酰基转移酶、脱水酶和酮还原酶。目前尚未有对其进行体外表达、纯化以及功能的研究报导。本研究建立了CalA3的体外表达、纯化体系,获得了高纯度、稳定的巨大蛋白,证明了CalA3具有DNA结合能力,同时,揭示了CalA3作为转录调控因子,正调控钙霉素生物合成的功能。通过探索不同的表达宿主、共表达分子伴侣和培养基的优化,获得最佳表达条件:在大肠杆菌BL21-Gold（DE3）中通过LBBS培养基与pGro7共表达,获得了该蛋白的最优可溶性高表达;通过Ni2+亲和层析、Heparin、离子交换和凝胶过滤层析多步纯化手段,对CalA3进行了有效分离纯化,获得了高纯度和稳定的蛋白;凝胶迁移实验证明CalA3具有DNA结合能力。通过反转录PCR,确定了钙霉素生物合成基因簇含有18个转录本。通过竞争性的凝胶迁移实验,证明了CalA3特异性地结合在calB1、calR2和calM的启动子区;calA3基因中断和回补实验表明calA3是钙霉生物合成中的必需基因;实时荧光定量PCR结果显示,野生型菌株中calB1的转录水平是?calA3的5倍,证明CalA3正调控calB1的转录;通过DNase I足迹法实验,确定了CalA3在calB1启动子区的结合位点,该区域位于calB1上游的-35区,且含有回文序列;体外凝胶阻滞实验表明钙霉素和cezomycin能使CalA3发生别构效应并从DNA结合位点解离。本研究建立了体外表达和纯化大型聚酮合酶CalA3蛋白的方法,以及探索了CalA3在钙霉素生物合成中的转录调控功能,成功获得了大蛋白在大肠杆菌中的异源表达和纯化,确定了CalA3具有体外结合DNA的能力,证明了CalA3正调控钙霉素的生物合成,并受钙霉素和cezomycin的反馈抑制调节,进一步完善了钙霉素生物合成机制的内容,为通过定向改造细菌优化钙霉素的功能提供理论基础。