水牛(Bubalus bubalus, Bb),哺乳纲牛科(Bovidae)水牛属,适宜于水田耕作。水牛奶质十分优良,所含蛋白质、氨基酸、乳脂、维生素、微量元素等均高于黑白花牛奶,其营养价值相当于黑白花牛奶的两倍,作为一类高级营养食品,水牛奶制品日渐成人们消费的“新宠”,在商业上具有潜在的巨大的价值。水牛肉,特别是小水牛肉,味香、鲜嫩,且脂肪含量少。另外,水牛角可以入中药。中国是水牛资源十分丰富的国家,据联合国粮农组织(FAO)统计资料,截止2003年,我国水牛饲养量为2275.9万头,已上升为世界第三位。结核病(Tuberculosis)由结核分枝杆菌引起的人畜共患病。人接触患结核病的水牛或者食用未经消毒的患结核病水牛的奶,会引起人的结核病。水牛感染结核病,成为制约奶水牛发展的潜在威胁。到目前为止,我国水牛结核病检疫还没有一套完整可行的方法,一直是采用黄牛的检测标准进行检测,即结核菌素皮内试验(TST)。TST为法定的黄牛结核病检疫方法,应用该标准检测水牛结核病误差较大,不适合水牛的检测。因此,寻找一种新型的水牛结核病检测方法迫在眉睫。干扰素是一类具有抗病毒、抗肿瘤和免疫调节作用的多种功能的免疫活性蛋白。γ-干扰素(IFN-γ)是Ⅱ型干扰素,IFN-γ体外释放法是目前检测结核病最具有应用前景的检测方法之一,它是在特异性抗IFN-γ单克隆抗体的基础上建立的对于待检样品中IFN-γ定性定量分析的一种实验方法。国外学者已经将抗原特异性IFN-γ试验的应用于多种动物疫病的检测。相对而言,水牛抗原特异性IFN-γ试验研究报道较少。本研究克隆表达并纯化了水牛IFN-γ(BbIFN-γ),对其进行了抗病毒活性分析,制备了抗BbIFN-γ单克隆抗体与多克隆抗体,并在此基础上建立了检测BbIFN-γ的双抗体夹心ELISA方法。1.水牛IFN-y的克隆与原核/酵母表达通过Con A刺激,从水牛全血中提取BbIFN-γmRNA,根据GenBank上发布的广西沼泽型水牛的IFN-y mRNA序列设计引物,扩增出cDNA,克隆到原核表达载体pET-30a,转化BL21,经IPTG诱导,表达出大小为22kD左右的可溶性重组蛋白。根据测序结果,把密码子改为毕赤酵母偏爱密码子并全基因合成,亚克隆到酵母穿梭质粒pPICZaA,转化酵母感受态GS115,经甲醇诱导,表达出18kD左右的蛋白。2.水牛IFN-y抗VSV/IBRV病毒活性的鉴定为了鉴定原核和酵母表达的蛋白是否具有抗病毒活性,检测了IFN-y抑制水疱性口炎病毒(VSV)和牛传染性鼻气管炎病毒(IBRV)在牛肾细胞系(MDBK)的增殖能力。结果显示,原核表达与酵母表达的两种蛋白的抗VSV活性分别为2.05×105U/mL和7.44×105U/mL,抗IBRV活性分别为5.22×104U/mL和2.61×105U/mL。所表达的两种重组BbINF-γ蛋白均具有抗病毒活性,原核表达的蛋白抗IBRV活性比酵母表达的偏低。3.水牛IFN-γ单/多克隆抗体的制备与鉴定本研究利用两种表达蛋白混合免疫Balb/C小鼠,并用两种蛋白分别筛选杂交瘤细胞株,获得五株高效价的单克隆抗体,分别命名为1C3、2C3、3E7、4G6、4H4,腹水效价分别为2.56×104、5.12×104、1.28×104、2.56×104、5.12×104。Western blot分析显示五株单抗均能特异性结合BbIFN-γ,表明五株单抗均为BbIFN-γ的特异性单抗。间接ELISA表明,McAb不与其他抗原反应,进一步证实其特异性良好。利用两种表达蛋白混合免疫日本大耳白兔,获得兔高免血清,经纯化得到多克隆抗体,Western blot分析显示多抗能特异性结合BbIFN-γ4.双抗体夹心ELISA方法的建立用2C3株单抗、多抗及辣根过氧化物酶(HRP)标记的羊抗兔IgG,建立双抗体夹心ELISA方法,检测BbIFN-γ,结果其检测的灵敏度达到125pg/mL,灵敏度高。该方法的建立为定量检测BbIFN-γ试剂盒的研制奠定了基础。该研究建立了高效的检测BbIFN-γ的免疫学方法,为水牛结核病的检测和防治奠定了基础。