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DNA双链断裂(DSBs)是DNA损伤类型中最严重的一种,延误修复会导致生物有机体基因组不稳定甚至引发细胞凋亡。DSB修复主要有两种途径:同源重组修复(HR)和非同源末端连接(NHEJ),其中HR途径主要发生在细胞周期S期和G2期,是细胞内一种高保真的修复方式。DSB的修复可以由两区域协作完成:1)“DNAdomain”-由游离的DSB末端组成,完成大部分修复;2)“γH2AX chromatin domain”-由染色质区域组成,作为辅助途径协同完成DSB修复。研究显示“γH2AX染色质区”对于损伤响应信号的扩大以及特定修复因子的招募起到了重要的作用,这显示出“γH2AX染色质区”对于DNA损伤修复的重要性。科学研究认为“γH2AX染色质区”的信号转导过程是:DSB产生后的γH2AX与MDC1的串联BRCT结构域直接结合,然后MDC1蛋白的其他结构域通过特异性磷酸化招募更多的DNA损伤修复相关蛋白来发挥修复功能。当细胞敲除H2AX或MDC1时,HR修复效率降低3-5倍。“γH2AX染色质区”通过招募大量修复因子参与HR的调控,但招募过程中的单个因子对其介导的HR修复功能则不是很清楚。特别是,H2AX缺陷造成的基因组不稳定性状明显弱于许多招募到染色质区的修复因子(如BRCA1和53PB1)的缺陷性状。根据文献报导,当把DNA损伤修复蛋白BRCA1单独敲除时,细胞HR修复水平明显下降甚至细胞死亡;而当BRCA1和53BP1同时敲除时,HR修复回到正常水平,提示我们DNA损伤修复相关蛋白间可能存在着拮抗作用。据此,我们提出一种假说:招募到“γH2AX染色质区”的许多DNA损伤修复因子在特定的状态下或细胞环境中,会从往常的拮抗状态下释放出来,参与特定环境下的同源重组修复的调控。为了检验这个假说,我们提出将招募到“γH2AX染色质区”的修复因子单独聚集到“γH2AX”染色质上,来研究单个因子对HR修复的调控。本研究检测三个损伤修复因子:MRE11、NBS1和XRCC4对HR修复的影响。其中,MRE11具有3’-5’外切酶活性和单链的DNA内切酶活性;NBS1是MRN复合物的调节因子,负责招募MRE11和RAD51。而XRCC4通过与XLF、DNA Ligase4一起在NHEJ途径中直接连接末端。具体地,我们首先利用CRISPR/Cas9基因编辑技术构建了 MDC1敲除的小鼠胚胎干细胞株,构建了能够表达融合蛋白的MDC1-/-细胞系。其次,我们分别构建了MRE11、NBS1、XRCC4与MDC1的融合蛋白。最后,为了验证MRE11-BRCT/NBS1-BRCT/XRCC4-BRCT可以与γH2AX直接结合,我们将质粒转染人骨肉瘤细胞U20S,进行免疫荧光实验并用流式细胞术进行检测。结果发现在MRE11-BRCT/XRCC4-BRCT可以形成明显foci,但这三个修复因子在“yH2AX染色质区”没有表现出对同源重组修复功能的调控作用。综上所述,我们利用dual-sgRNA技术可以成功敲除MDC1基因,但本实验中MRE11-BRCT/NBS1-BRCT/XRCC4-BRCT在“γH2AX染色质区”均没有明显的同源重组修复功能。