论文部分内容阅读
嗜碱盐单胞菌(Halomonas alkaliphila)DSM 16354T是一株可生长在10%的NaCl及p H 9.0碱性环境中的一种中度嗜盐和嗜碱菌。中度嗜盐菌指的是在0.1%-32.5%Na Cl环境中能够正常生长,代谢的微生物类群。它作为细菌耐盐碱机制的重要研究对象,基因的类别有很多且耐盐机制也很复杂。对中度嗜盐菌的耐盐碱基因资源进行挖掘,是深入研究微生物盐适应机制和开发利用微生物资源的重要前提。它与一般的非嗜盐菌相比,具有相对独特的生理生化结构、代谢途径、以及遗传学特性等。本研究利用基因文库与大肠杆菌(Escherichia coli)钠/氢逆向转运蛋白缺陷株KNabc(Δnha A、Δnha B、Δcha A)功能互补相结合的方法,从Halomonas alkaliphila DSM 16354T中克隆获得一个重组质粒p UC-SN11。它编码钠/氢逆向转运蛋白(Na~+/H~+antiporter)。耐盐碱实验表明,KNabc/p UC-SN11能在含0.2 M Na Cl的LBK培养基中生长。并初步预测该质粒包含的序列可能编码Na~+/H~+逆向转运蛋白。序列分析发现pUC-SN11携带的DNA片段长5662 bp,有3个完整的阅读框(ORF)。经过比对,ORF1(1-1324 bp)与盐单胞菌属(Halomonas campaniensis)中的TRAP dicarboxylate transporter subunit Dct M同源性最高可达99%。ORF2(1414-2389 bp)与盐单胞菌属(Halomonas campaniensis)中TRAP ABC transporter substrate-binding protein同源性最高可达99%。ORF3(2833-4309 bp)与盐单胞菌属(Halomonas campaniensis)中的sodium:proton antiporter(NhaD)的同源性最高可达99%。由于ORF3编码一个单亚基的钠/氢逆向转运蛋白,因此推测起作用的阅读框是ORF3。所以本研究直接对ORF3进行亚克隆。因其来自嗜碱盐单胞菌(Halomonas alkaliphila)DSM 16354T而被定名为Ha_nhaD。将Ha_NhaD与已鉴定的NhaD型钠/氢逆向转运蛋白进行氨基酸序列比对,比对的蛋白分别是Ha_NhaD2(来自Halomonas sp.Y2)、Aa_NhaD(来自Alkalimonas amylolytica)、Ha_NhaD1(来自Halomonas sp.Y2)、He_NhaD(来自Halomonas elongata)、Vc_NhaD(来自Vibrio cholerae)、Vp_NhaD(来自Vibrio parahaemolyticus)、Dl_NhaD(来自the metagenome of halophilic bacteria in Daban Salt Lake)和Dw_NhaD(来自the metagenome of halophilic bacteria in Dagong Ancient Brine Well),比对结果同源性依次为91%、72%、70%、64%、60%、56%、17%和11%。为了证明它是否是一个新型的NhaD型钠/氢逆向转运蛋白,采用邻接法构建系统发育树。此发育树包括7个最近的同系物,同源性在76%-99%之间,7个较近的同系物同源性在50%-75%之间和7个较远的同系物同源性在20%-49%之间,同时包括8个已经鉴定的钠/氢逆向转运蛋白。结果表明,它与其同系物聚在一起并形成了自己独立的分支。所以我们认为Ha_NhaD是一个新型的NhaD型钠/氢逆向转运蛋白。耐盐碱测试表明,含有重组质粒pUC-nhaD的大肠杆菌(E.coli)KNabc(Δnha A、Δnha B、Δcha A)能在0.6 M Na Cl、0.2 M Li Cl及p H 8.0的碱性环境中生长。拓扑异构学结构分析显示,Ha_NhaD含有12个TMS的跨膜蛋白,表明蛋白是一个低极性的跨膜蛋白。本研究测试了含有nhaD基因的重组质粒pUC-nhaD的大肠杆菌(E.coli)KNabc转化子的阳离子/H~+逆向转运蛋白活性。结果证实了KNabc/p UC-nhaD具有Na~+(Li~+)/H~+逆向转运活性。进一步测定了不同pH值对NhaD的阳离子/H~+逆向转运蛋白活性的影响,结果显示Ha_NhaD逆向转运蛋白活性在p H 6.5-9.5范围内表现出p H依赖性。为了确定Ha_NhaD对阳离子的亲和力,测定了KNabc/p UC-nhaD反转膜在最适pH条件下Ha_NhaD蛋白对Na~+、Li~+的K0.5值,测定结果显示NhaD蛋白的底物亲和性为:Na~+>Li~+。综上所述,Ha_nhaD基因编码一个新型的NhaD型Na~+/H~+逆向转运蛋白。