脑缺血疾病是目前严重危害人类健康的主要疾病之一,具有发病率高、致残率高、死亡率高的特点。脑缺血后引起一系列病理生理方面的改变,而影响脑缺血损伤的机制较复杂，包括兴奋性损害、Ca²⁺超载、自由基及脂质过氧化、线粒体功能障碍、NO、细胞凋亡，细胞因子等，这些因素之间可能还存在相互作用。因此探索脑缺血的病理生理过程，研究抗脑缺血损伤的药物越来越受到重视。随着研究深入，发现硫化氢（hydrogensulfide，H₂S）广泛参与机体多种生理病理过程，被认为是继一氧化氮（nitricoxide, NO）和一氧化碳（carbon monoxide, CO）之后的第三种气体信号分子，尤其是内源性H₂S作为一种新型神经活性物质，对中枢神经系统功能有着重要的调节作用。内源性H₂S在哺乳动物体内的产生主要有3条途径，即胱硫醚-β-合酶（cystathionine-β-synthase,CBS）和胱硫醚-γ-裂解酶（cystathio-nine-γ-lyase,CSE）途径，主要以半胱氨酸为底物通过转硫作用生成H₂S，近年发现第三种途径，即3-巯基丙酮酸硫转移酶（3-merca-ptopyruvat sulfur transferase,3MST）途径，3MST与半胱氨酸转氨酶（cysteine amino transferase, CAT）共同作用，以L-半胱氨酸和a-酮戊二酸为底物，生成H₂S。研究发现H₂S参与脑缺血性损伤的发生，且在脑缺血性损伤时呈现动态变化过程；有学者发现H₂S可通过对抗线粒体氧化应激作用，保护神经细胞避免氧化损伤，因此我们建立大鼠局灶性大脑中动脉栓塞（middle cerebral artery occlusion, MCAO）模型，观察大鼠在局灶性脑缺血过程中不同时间内源性H₂S含量与3MST活性的变化，在此基础上给予大鼠H₂S的供体-硫氢化钠（sodium hydrosulfide，NaHS），观察其对缺血后脑组织线粒体损伤的影响。第一部分局灶性脑缺血大鼠脑组织硫化氢与3-巯基丙酮酸硫转移酶的变化目的：观察大鼠局灶性脑缺血过程中不同时间内源性H₂S含量与3MST的变化。方法：健康成年雄性SD大鼠共192只（96×2），体重250-300g，随机分为：①假手术组×2：仅做颈部手术，不插入线栓。②缺血1h组×2；③缺血3h组×2；④缺血6h组×2；⑤缺血9h组×2；⑥缺血12h组×2；⑦缺血24h组×2。假手术组共48只（不同时间点各8只），其余各组各8只。其中96只观察计算梗死体积，另96只测定其他指标。采用Zea-Longa等线栓法建立局灶性脑缺血模型，大鼠10%水合氯醛麻醉，消毒皮肤，取颈正中切口，分离组织，游离左侧颈总动脉（commoncarotid artery, CCA）、颈外动脉（external carotid artery, ECA）、颈内动脉（internal carotid artery, ICA），电凝颈外动脉的分支及颈外动脉与颈内动脉的交通支，结扎颈外动脉远心端，电灼断，在结扎部位近心端剪一小口入栓塞线，栓线进入颈内动脉，直至大脑中动脉的起始处，长度约18.5mm左右。假手术组只做颈部手术，游离血管，但不插入线栓。参照Longa评分法，对大鼠进行神经功能缺损程度的评分，以判定模型是否成功。分别于术后1h、3h、6h、9h、12h和24h后断头取脑，脑组织切片染色，观察并计算脑梗死体积。检测脑组织中H₂S水平，参照Qu、Kimura等的研究方法并改良测3-巯基丙酮酸硫转移酶的活性。结果：1假手术组神经功能正常。与相应的假手术组比较，缺血1h组无明显神经功能缺损症状，从缺血3h到24h，出现不同程度的神经功能缺损症状。2假手术组大鼠脑组织无梗死。与相应的假手术组比较，缺血1h时大鼠脑组织无明显梗死，缺血3h时出现梗死灶，随着时间的延长，缺血6h、9h、12h和24h时梗死灶逐渐增大（P<0.01）。3假手术组大鼠在1h～24h之间脑组织中H₂S含量和3MST活性无明显变化。与相应的假手术组比较，缺血1h时H₂S含量和3MST活性无明显变化，随时间的延长，缺血3h、6h、9h、12h和24h各组大鼠脑组织中H₂S含量和3MST活性均明显降低（P<0.05或P<0.01）。小结：通过建立大鼠局灶性大脑中动脉栓塞模型，观察了大鼠体内，H₂S含量和3MST活性在缺血不同时间的动态变化及脑组织梗死体积的改变，结果表明在缺血3h后，随缺血时间延长， H₂S含量和3MST活性明显降低，脑组织梗死体积逐渐增大，提示H₂S与3MST参与了局灶性脑缺血的发生发展。第二部分硫化氢对局灶性脑缺血大鼠脑线粒体功能的影响目的：观察H₂S对大鼠局灶性脑缺血后脑线粒体功能的影响。方法：健康成年SD大鼠80只（40×2），随机分为：①、假手术组×2；②、缺血模型组×2；③、缺血+NaHS高剂量组×2；④、缺血+NaHS中剂量组×2；⑤、缺血+NaHS低剂量组×2。其中40只观察计算梗死体积，另40只测定其他指标。参照Zea-Longa等线栓法建立局灶性大脑中动脉栓塞（MCAO）模型。假手术组只做颈部手术，游离血管但不插入线栓。术后24h迅速断头取脑，检测大鼠脑组织中H₂S含量和3MST的活性，观察给予NaHS后脑缺血体积的改变情况。透射电镜下观察给予NaHS后，对神经元线粒体超微结构改变的影响。采用差速离心法提取神经元线粒体，测定线粒体的活力、线粒体膜肿胀度，以及线粒体总ATP酶、超氧化物岐化酶（SOD）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-PX）活性和丙二醛（MDA）含量。结果：1与假手术组大鼠比较，缺血组大鼠出现明显脑梗死灶（P<0.01）。与缺血组大鼠比较，缺血+NaHS高、中剂量组大鼠脑梗死体积明显减小（P<0.01），缺血+NaHS低剂量组大鼠脑梗死体积无明显变化。2与假手术组大鼠比较，缺血组大鼠脑组织内H₂S含量与3MST活性明显降低（P<0.01）。与缺血组大鼠比较，缺血+NaHS高、中剂量组大鼠脑组织内H₂S含量与3MST活性明显升高（P<0.05或P<0.01），而在缺血+NaHS低剂量组大鼠脑组织内H₂S含量与3MST活性无明显变化。3与假手术组大鼠比较，缺血组大鼠神经元线粒体总ATP酶、SOD、GSH-PX活性明显降低（P<0.01），MDA含量明显升高（P<0.01），神经元线粒体膜肿胀、线粒体活力下降，吸光值分别在波长为540nm和570nm下降（P<0.05或P<0.01），与缺血组大鼠比较，缺血+NaHS高、中剂量组大鼠神经元线粒体总ATP酶、SOD、GSH-PX活性升高，MDA含量降低，脑线粒体膜肿胀、线粒体活力明显改善（P<0.05或P<0.01），缺血+NaHS低剂量组大鼠与缺血组比较没有明显差异。4电镜观察脑组织形态学变化：假手术组大鼠神经元结构清晰，排列整齐。缺血组大鼠神经元细胞水肿，线粒体膜肿胀、部分嵴断裂消失，细胞器数量减少。NaHS高、中剂量组大鼠也有神经元损伤的改变，但程度较缺血组轻，缺血+NaHS低剂量组大鼠脑组织损伤程度，与缺血组比较未见明显变化。小结：应用大鼠局灶性脑缺血模型，观察了H₂S供体NaHS对脑缺血损伤及线粒体功能的影响，结果表明，NaHS可使3MST活性增强，H₂S生成增加，明显缩小脑梗死体积，明显升高线粒体活力，降低线粒体膜肿胀度，增强线粒体总ATP酶、SOD、GSH-PX活性，降低MDA含量，明显改善脑缺血组织损伤。结论：1大鼠局灶性脑缺血，缺血3h后，随缺血时间延长，内源性H₂S含量和3MST活性均明显降低，脑组织明显受损，提示H₂S/3MST可能参与了局灶性脑缺血的病理生理过程。2H₂S可通过增强线粒体ATP酶、SOD和GSH-PX活性，降低MDA含量，增强线粒体活力，降低线粒体膜肿胀度，明显改善缺血脑组织损伤。