香蕉穿孔线虫[Radopholus similis(Cobb，1893)Thorne，1949]是一种毁灭性的迁移性内寄生植物病原线虫，是我国禁止进境一类检疫性植物有害生物，欧盟、美国等大多数国家都对其实施检疫。该线虫寄主范围广泛，已知寄主达360种以上，严重危害香蕉(Musa spp.)、柑橘(Citrus spp.)、胡椒(Prper nigrum)、生姜(Zingiber officinale)和观赏植物等多种经济作物，是目前世界香蕉产量损失的主要原因之一。 组织蛋白酶B(Cathepsin B：EC3.4.22.1)属于溶酶体内半胱氨酸蛋白水解酶，广泛分布于寄生和自由生活线虫中。近年来研究表明，Cathepsin B在寄生虫卵的孵化、入侵寄主、对宿主致病和免疫逃避等生理生化过程中有极其重要的作用。因此Cathepsin B在控制寄生虫病方面有很重要的研究价值。目前关于植物寄生线虫组织蛋白酶的研究较少，而有关植物寄生线虫Cathepsin B的研究迄今未见报道。 本研究应用SMART技术构建香蕉穿孔线虫cDNA表达文库，分别对76条EST序列进行了Blast分析，其中33条序列为unigenes。Blast X分析表明：58％的序列与线虫类生物基因序列相似，其中2条序列与动物寄生线虫基因序列相似，17条序列与自由生活线虫基因序列相似；18％的ESTs序列与昆虫基因序列相似；9％的ESTs序列与细菌基因序列相似；6％的ESTs序列与真菌基因序列相似；9％的序列为新基因序列。 本文利用秀丽小杆线虫(Caenorhabditis elegans)Cathepsin B基因为探针，通过反向Northern Blot杂交鉴定到香蕉穿孔线虫Cathepsin B基因序列，并应用SL法克隆到该基因cDNA序列全长为1257bp，该基因编码的蛋白质由1071个碱基编码356个氨基酸，分子量为41.4088024KD，将其命名为Rs-cb-l。利用同源建模法对Rs-cb-1编码蛋白的三维结构进行了预测。对Rs-cb-1编码蛋白功能分析表明，该蛋白主要为细胞外分泌蛋白；亚细胞定位于微体(过氧化物酶体)、内质网膜和内质网管腔上，约有25个氨基酸跨膜区段位于蛋白质的C端，这与Cathepsin B的生物学功能相吻合。蛋白表面电荷呈明显的极性分布，表明该蛋白存在受体蛋白和底物蛋白。以秀丽小杆线虫的Cathepsin B蛋白F57F5.1为模版进行Cathepsin B蛋白互作网络同源预测。表明该基因分别与核酸外切酶R09B3.1、转录过程蛋白F10G7.4.1、蛋白酶调节子F56H1.4.2和蛋白酶调节子B0205.3.1有直接互作关系。 原位杂交技术对香蕉穿孔线虫Rs-cb-1进行组织定位结果表明Rs-c6-1的表达部位为线虫的肠道和生殖腺。利用Rs-cb-1 dsRNA处理香蕉穿孔线虫，进行RNAi试验。研究Rs-cb-1基因沉默的香蕉穿孔线虫胚胎发育变化，并验证．Rs-cb-1基因沉默的香蕉穿孔线虫与野生型香蕉穿孔线虫在巴西蕉苗和胡萝卜愈伤组织上的生长繁殖差异。结果表明Cathepsin B基因影响雌成虫卵母细胞的发生、分化和子宫内卵的正常发育，对已产出卵的正常胚胎发育及二龄幼虫的生长发育有一定的抑制作用。接种有RNAi处理线虫的胡萝卜培养基上未表现线虫大面积扩繁的明显症状，线虫繁殖率明显受到抑制。表明CathepsinB基因影响香蕉穿孔线虫生长发育和繁殖。接种经RNAi处理线虫的巴西蕉苗生长状况明显优于接种野生型线虫的巴西蕉苗；接种有RNAi处理线虫的巴西蕉苗的根系褐色病斑数量明显少于接种野生型线虫的巴西蕉苗根系；根组织切片显微镜检验表明RNAi处理组线虫未对巴西蕉根组织产生明显侵染作用，在所观察的切片中未发现有卵或线虫，根组织细胞表现正常。表明RNAi处理线虫对寄主植物的寄生和致病性较弱。 利用显微注射法将构建有Rs-cb-1基因序列的GFP Fusion TOPO表达载体转入线虫体内。GFP标记蛋白在穿孔线虫食道球后部至肛门前部有所表达，体中部的肠道和生殖腺部位绿色荧光亮度高，表明表达量较大。 将Rs-cb-1基因序列连接到pQE30-UA原核表达载体上，转化大肠杆菌JM109菌株，IPTG的诱导下产生约44KDa的融合蛋白。测定pQE30-UA-Rs-cb-1原核表达产物对胡萝卜愈伤组织和巴西蕉根组织的作用，结果表明其对胡萝卜愈伤组织和根组织细胞有一定的破坏降解作用。 本研究首次克隆了香蕉穿孔线虫Cathepsin B基因全长cDNA，对该基因编码的蛋白质进行了三维结构预测；初步证明了香蕉穿孔线虫Cathepsin B基因表达部位为线虫的肠道和生殖腺，与线虫的生长发育、繁殖以及寄生相关；将构建cDNA表达文库的SMART方法与用SL法进行PCR扩增的技术相结合，克隆功能基因全长序列的方法为线虫功能基因克隆提供了简便、快速的方法；同源建模为快速、实用、简便的研究预测线虫蛋白质三维结构提供了一个成功范例。为进一步系统开展香蕉穿孔线虫Cathepsin B基因研究奠定了基础。