乳酸是一种重要的有机酸,广泛应用于食品、生物、化工等行业。近年来,随着环保意识的不断增强,推动了聚乳酸行业的快速发展,也进一步加大了对高品质乳酸单体的需求,如何高效生产高质量乳酸是目前亟待解决的难题。适应性进化及代谢工程可对菌株进行定向改造,而在代谢工程中,无论是表达系统构建还是产物的优化表达都离不开启动子的调控。乳酸菌中具有不同调控活性启动子的缺乏,是进行细胞代谢精准调控的一大阻碍。本研究通过构建和应用RNA探针对启动子进行高通量筛选,建立适用于拟干酪乳杆菌的具有不同调控活性的启动子库;此外,通过适应性进化及CRISPR-Cas9基因编辑技术对菌株进行改造,以满足工业乳酸生产对菌株性能的需求。首先,利用RNA探针Pepper构建了乳酸菌中RNA水平启动子探针。通过对比eGFP（enhance green fluorescent protein）和Pepper表征的启动子强度及相关性分析,证明了 Pepper作为报告基因在乳酸菌中应用的可行性和可靠性,并基于此构建了 RNA水平启动子探针。同时,结果表明可先在大肠杆菌中对启动子强度进行初步检测,然后再转化到拟干酪乳杆菌进行调控活性的验证。此外,通过优化乳酸菌接种量和培养时间,建立了合适的Pepper荧光测定方法,发现初始接种量为5%时,培养4 h可获得最佳的荧光检测值。其次,建立了基于Pepper探针的拟干酪乳杆菌启动子库。通过易错PCR获得P32启动子突变片段,利用构建的RNA探针Pepper进行启动子强度的表征。首先在大肠杆菌中进行高通量筛选,共筛选了 950株突变菌,选择调控活性在P32荧光强度0.5-8倍范围内且强度呈梯度变化的10个转化子,转化到拟干酪乳杆菌后,其启动子强度与大肠杆菌启动子强度的相关性系数达到0.94,进而组成拟干酪乳杆菌功能性启动子库。最后,选育获得耐高温高质量L-乳酸高效生产菌。应用适应性进化策略,经过2160个小时的连续传代培养,获得一株能耐受45℃高温的拟干酪乳杆菌（high temperature,HT）,其发酵培养24 h后基本能够恢复出发菌株在37℃时发酵性能。将HT菌株在高初糖浓度（250 g/L）下进行开放式发酵,获得的L-乳酸浓度为221.0 g/L,产率为7.51 g/L/h,转化率为0.963 g/g,光学纯度和化学纯度均高于99.0%,其发酵性能较所查文献中报道的其它乳酸生产菌更优,有望成为潜在的工业高质量L-乳酸高效生产菌株。此外,为进一步提高L-乳酸光学纯度,满足聚乳酸对高品质乳酸单体的需求,利用CRISPR-Cas9基因编辑技术构建了靶向敲除D-2-羟基酸脱氢酶基因的质粒,可能受限于电转条件或CRISPR-Cas9表达元件的设计,暂未能筛选获得相应的敲除菌株。本研究为接下来进一步的高光学纯度乳酸生产菌株改造奠定了基础。