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宫颈癌是全球女性第四大常见的癌症,每年全球新发病例数约占所有肿瘤类型的10%。人乳头瘤病毒(Human papillomavirus,HPV)感染导致的宿主细胞周期的失调是导致宫颈癌发生和恶性进展的一大主要原因,但细胞内的HPV DNA本身的存在也许不足以诱发癌症,可能需要更多的遗传和表观遗传事件。DONSON(downstream neighbor of SON)蛋白是人类21号染色体上一段10kb的基因编码的蛋白,并且在多种细胞动物和植物中高度保守,但其功能还有待确定。DONSON蛋白是新发现的复制体的组成成分,DONSON蛋白的丢失将导致基因组不能及时完成复制,并在S期增加DNA损伤,破坏复制叉的稳定性。对芬兰人群的早发性结肠癌病例中发现了DONSON纯合变异。但DONSON基因在宫颈癌发生发展中起到什么样的作用,目前尚不清楚。本课题将从三个方面进行研究:(1)通过生物信息学数据库及GSVA(Gene Set Variant Analysis)算法,对DONSON在宫颈癌组织和细胞中的表达及可能的功能和调节机制进行初步预测;(2)利用siRNA对宫颈癌SiHa及C33A细胞系中的DONSON表达进行干扰,初步探索DONSON的缺失对宫颈癌细胞的肿瘤生物学行为的影响;(3)利用慢病毒包装的shRNA构建DONSON干扰的稳转细胞系,并构建宫颈癌裸鼠皮下移植瘤模型,对DONSON基因在宫颈癌中影响细胞周期、凋亡的机制进行初步探索。第一部分DONSON在宫颈癌组织及细胞中的表达情况及功能预测目的:通过简单的生物信息学方法,观察DONSON基因及其共表达基因在宫颈癌芯片中的表达,对DONSON在宫颈癌中的生物学功能进行初步预测,并预测其可能的调控机制。方法:首先利用Oncomine数据库,观察DONSON基因及其共表达基因在宫颈癌组织芯片中的表达;随后在GEO数据库中获取两个GSE数据集,并分别观察数据集中组织样本及细胞样本中的DONSON表达;利用GEPIA 2在线网站,对DONSON在宫颈癌中的预后作用进行分析;最后通过GSVA包对TCGA CSEC数据集及GSE数据集进行富集分析,预测可能的调控机制。结果:DONSON基因在宫颈癌组织中的表达高于正常宫颈上皮组织,且与多种转录因子(如E2F1)、DNA复制体(如MCM复合物)、细胞周期依赖的激酶抑制剂(如CDKN2A)等基因的共表达相关系数较高;在几种宫颈癌细胞中,SiHa细胞的DONSON基因表达最高;DONSON表达较低时,宫颈癌患者DFS结果较好;GSVA计算结果发现,DONSON相关的激活通路可能与E2F转录因子靶点相关。结论:DONSON基因在宫颈癌中可能受到E2F转录因子的调控,激活mTOR等信号通路,调节细胞周期,促进肿瘤细胞的增殖,并影响宫颈癌患者的预后。第二部分DONSON对宫颈癌细胞生物学行为的影响目的:通过特异性DONSON-siRNA转染,观察干扰DONSON表达对肿瘤细胞生物学行为的影响,初步探索DONSON基因在宫颈癌细胞中的作用。方法:qPCR法检测几种常用的宫颈癌细胞系中DONSON基因的基础表达情况。细胞免疫荧光技术观察DONSON蛋白在宫颈癌细胞中的表达定位。qPCR法和western blot法分别检测转染后的DONSON在mRNA和蛋白水平的表达。MTT法检测绘制转染后宫颈癌细胞的生长曲线。流式细胞术检测转染后宫颈癌细胞周期和凋亡情况。划痕实验检测转染后宫颈癌细胞的迁移能力。Western blot法检测干扰后凋亡相关蛋白(caspase3、BCL2、BAX)的表达。结果:qPCR检测发现DONSON基因在SiHa细胞中表达最高,其次为C33A细胞。转染DONSON-siRNA后,宫颈癌细胞增殖能力显著降低,细胞周期S期阻滞,细胞凋亡增多。对凋亡相关蛋白的检测,caspase3、BAX表达升高,BCL2表达降低。但转染DONSON-siRNA对两种宫颈癌细胞的迁移能力没有明显影响。结论:干扰DONSON的表达可抑制SiHa和C33A宫颈癌细胞系的增殖,促进细胞凋亡;并且对细胞增殖的抑制可能是通过抑制细胞周期S期的进展导致的,促进细胞凋亡可能是通过BCL-2/BAX信号通路介导。第三部分shDONSON稳转细胞系的构建及其对宫颈癌裸鼠皮下移植瘤成瘤的影响目的:构建稳定干扰DONSON表达的宫颈癌细胞系,在此基础上,通过动物实验对DONSON在肿瘤中的生物学功能及其内在机制进行初步研究。方法:构建DONSON shRNA慢病毒,并构建稳定干扰DONSON的宫颈癌细胞系,通过MTT法、细胞克隆形成实验、流式细胞术等方法检测DONSON基因对宫颈癌的增殖、克隆形成、凋亡的影响;在此基础上,构建宫颈癌裸鼠皮下移植瘤模型,来探讨DONSON基因对宫颈癌移植瘤成瘤形成的影响。Western blot检测稳定干扰DONSON的宫颈癌细胞中PI3K/AKT/mTOR通路蛋白的表达。结果:MTT法和细胞平板克隆形成结果发现shDONSON显著降低宫颈癌细胞的增殖能力,流式细胞术验证shDONSON会导致宫颈癌细胞S期阻滞,增加细胞凋亡。Western blot结果显示,PI3K和AKT蛋白表达没有明显改变,pAKT和p-mTOR降低。动物模型证实shDONSON可显著减缓在体肿瘤组织的生长,促进细胞凋亡。结论:DONSON基因在宫颈癌中可能发挥着促癌作用。干扰DONSON可通过抑制细胞周期S期的进展宫颈癌细胞的增殖,抑制细胞克隆形成,促进细胞凋亡,这些功能可能是通过抑制PI3K/AKT/mTOR通路的活性介导的。在体实验证实,干扰DONSON的表达可抑制裸鼠移植瘤的生长,促进细胞凋亡。