本项工作主要研究CUE domain containing2(CUEDC2)蛋白质在热休克反应以及内质网应激反应中发挥的作用,发现CUEDC2蛋白质参与到上述两条通路中,发挥了重要的的功能。CUEDC2是一个含有CUE结构域的基因,对它的功能研究比较少。CUE结构域为一个大约含有40个氨基酸的序列,存在于许多的真核细胞蛋白质中,如Tollip、TAB2、TAB3、VPS9等。含有CUE结构域的蛋白质广泛参与细胞内的信号转导,发挥重要的功能。我们前期工作发现CUEDC2能够与孕激素受体progesterone receptor(PR)发生相互作用,促进孕激素依赖的孕激素受体发生泛素化并且降解,从而提示CUEDC2可能参与了乳腺癌的发生发展(The EMBO Journal,2007)。进一步研究还发现,CUEDC2能够与IKKalpha、IKKbeta发生相互作用,并且通过招募 growth arrest and DNA-damage-inducible34(GADD34)和protein phosphatase1(PP1)使IKK复合体发生去磷酸化,抑制NF-κB信号通路(Nature Immunology,2008)。以上对CUEDC2的研究提示CUEDC2可能参与不同的信号通路,并发挥不同的生物学功能。本项工作主要探讨 CUEDC2在热休克反应以及内质网应激反应中发挥的作用及其机制。　　为了进一步研究CUEDC2的功能,我们运用亲和纯化结合质谱的方法,鉴定了CUEDC2与heat shock70kDa protein(HSP70)和heat shock cognate70kDa protein(HSC70)存在相互作用。已知HSP70与HSC70具有较高的保守性,而且研究发现HSP70参与了众多的细胞内反应过程,具有更为广泛的功能,因此,本研究着重探讨CUEDC2与HSP70之间相互作用的意义。我们首先通过免疫共沉淀实验验证了这一相互作用,并且证明了CUEDC2与HSP70存在热休克反应依赖的内源相互作用。免疫荧光实验证实了CUEDC2与HSP70具有细胞内共定位,并且在热激后,这种共定位有所增强。进一步研究证实,CUEDC2的CUE结构域介导了这两个蛋白质之间的相互作用,HSP70通过其peptide binding domain(PBD)结构域和carboxyl-terminal sequence(CT)区域与CUEDC2发生相互作用。HSP70包含三个确定的结构域,分别是ATP酶结构域,肽结合结构域和C末端的一段保守序列。ATP酶结构域参与ATP的水解,与HSP70的伴侣功能相关;肽结合结构域是HSP70与底物的结合区,HSP70的许多底物如AIF, JNK等均与此区域结合;HSP70的C末端包含Glu-Glu-Val-Asp四个非常保守的氨基酸,这一区域对于HSP70的许多共伴侣如HSP40、HOP、CHIP结合HSP70十分重要,这些共伴侣通过与HSP70的C末端结合调节HSP70的伴侣功能。由于本项研究发现CUEDC2结合的是HSP70的PBD和C末端区域,因此我们推测,CUEDC2可能能够调控HSP70的伴侣功能。我们通过细胞内的荧光素酶重折叠实验发现细胞内过表达CUEDC2能够抑制HSP70介导的伴侣功能,缺失HSP70结合区域的CUEDC2突变体对HSP70的伴侣功能没有明显影响,说明CUEDC2能够调控HSP70的伴侣功能。而HSP70的一些共伴侣,如CHIP、Hip等,除了调节HSP70的伴侣功能外,还能够参与热休克反应及其信号转导。为了检测CUEDC2是否参与了热休克反应,我们分别对稳定和瞬时干涉CUEDC2的细胞进行了热激,结果发现,干涉CUEDC2的表达能够抑制热应激诱导的HSP70的表达。由于热激过程中热休克蛋白质的表达受到转录因子 Heat shock transcription factor1(HSF1)的调控,通过双荧光报告系统测活实验发现,干涉CUEDC2能够明显抑制热激诱导的HSF1的转录活性,而过表达CUEDC2能够促进热激诱导的HSF1的转录活性。免疫共沉淀实验证实在热激之后,CUEDC2能够与HSF1结合,提示CUEDC2影响HSF1转录活性可能与这两者结合有关。以上研究发现CUEDC2能够通过与HSP70结合,参与调节HSP70的伴侣活性,并且通过与HSF1结合调节了热应激反应中热休克蛋白质的诱导表达,从而揭示了一个新的热休克反应调节蛋白质,也为CUEDC2的功能研究提供了新的线索。　　缺氧、氧化应激、高脂肪饮食、低血糖、病毒感染等多种刺激和一些病理情况均能引起内质网内未折叠蛋白质的聚集,引起内质网应激反应。近年来研究发现,内质网应激与众多人类疾病相关,如神经退行性疾病、双向性精神障碍、肿瘤、中风、缺血再灌注损伤、心脏疾病、糖尿病等。内质网应激反应激活的细胞内主要信号通路是未折叠蛋白质反应(UPR)。UPR主要包括三条通路,即IRE1α-ASK1-JNK(IRE1α-XBP1), PERK-EIF2α以及ATF6通路。前期工作中我们发现 CUEDC2可能参与对 JNK通路的调控,基于此线索,我们研究了CUEDC2在内质网应激反应中发挥的作用。首先我们运用高渗透压应激等不同种刺激处理细胞,发现在干涉CUEDC2的细胞中,内质网应激激活的JNK活性降低。之后我们通过不同的内质网应激诱导剂,以及在稳定干涉和瞬时干涉的细胞中都验证了这一结果。而干涉CUEDC2对于高渗透压激活的JNK通路没有影响。内质网应激诱导的JNK激活是由内质网膜上的IRE1α招募 TRAF2、ASK1介导的。我们首先考虑CUEDC2影响JNK激活的作用位点应该不会在MAPKK(MKK4, MKK7)和JNK水平,因为已知不同种刺激几乎都是通过 MKK4和MKK7激活JNK,如果CUEDC2影响的是MAPKK和JNK,那么多种刺激激活的JNK都应该受到影响,这与我们的实验结果不符。另外,也未发现CUEDC2与JNK存在相互作用(论文第一部分结果)。因此,CUEDC2在内质网应激反应中最有可能影响的蛋白质是TRAF2、IRE1α和ASK1。通过免疫共沉淀实验我们发现 CUEDC2能够与 ASK1发生相互作用,而与另一MAPKKK水平激酶MEKK1之间不存在相互作用。之后证明了CUEDC2与ASK1之间的相互作用是内质网应激刺激依赖的。免疫共沉淀实验证实CUEDC2的C末端(133-287)介导了CUEDC2与ASK1的相互作用,而ASK1的C端介导了这两个蛋白质之间的相互作用。内质网应激激活 IRE1α-ASK1-JNK信号通路的一个重要结果是细胞死亡,这一点在神经退行性疾病和心脏疾病的发生发展中发挥重要的作用。另外,内质网应激诱导的JNK激活在Ⅱ型糖尿病的发生发展过程中扮演重要的角色。我们之后的研究将着重探索 CUEDC2在内质网应激诱导的细胞死亡以及胰岛素受体耐受过程中发挥的作用。以上研究证实在内质网应激时 CUEDC2通过与ASK1结合调节JNK的激活,并且确定了CUEDC2与ASK1相互作用的区域。在今后的研究中,我们将进一步研究这一现象的生物学意义以及在疾病中可能发挥的功能。　　以上两部分工作由于涉及CUEDC2参与不同的信号通路及其相对独立的功能,因此分为两部分展示。当然,CUEDC2这两种不同的功能可能具有内在的联系,如热休克反应和内质网应激反应都与蛋白质错误折叠以及蛋白质结构功能损伤有关,CUEDC2是否参与其他蛋白质损伤引起的应激反应将在今后进一步探索。