目的:NK细胞是天然免疫系统的主要效应细胞，具有广泛的生物学功能，位于机体抵抗肿瘤和病毒感染的第一道防线；不需要预先刺激即可识别并杀伤肿瘤和病毒感染的细胞，同时又能通过早期分泌多种细胞因子(如IFγ、GM-CSF和TNF-β)和趋化因子来调节获得性免疫应答，因此，是连接天然免疫和获得性免疫的桥梁。NK细胞及其分泌的细胞因子不仅参与调节天然免疫和获得性免疫，而且参与调节造血系统的功能，在血液系统疾病，尤其是异基因骨髓移植中，在抑制和预防GVHD，促进GVT效应和促进血液和免疫系统重建方面起重要作用。 同时，NK细胞对自身免疫性疾病的调节亦引起了人们的重视。因此，尽管关于NK细胞的发育分化和识别功能的研究远远滞后于T细胞和B细胞，近年来，关于NK细胞功能和调节的研究引起了人们极大的兴趣，并有了突飞猛进的发展，成为免疫学研究的一大热点。 近期的研究发现，NK细胞表面存在识别靶细胞表面分子的活化受体和抑制性受体，NK细胞的效应功能取决于活化信号与抑制性信号的综合。抑制性受体能特异性识别靶细胞表面的MHCⅠ类分子并保护正常细胞不被杀伤，人的NK细胞抑制性受体主要有杀伤细胞免疫球蛋白样受体(killercellIg-likereceptors，KIR)和凝集素样受体CD94/NKG2A，在调节NK细胞功能方面起重要作用。活化受体识别经典、非经典的MHCⅠ类分子或MHCⅠ类相关分子，在NK活化的启动方面起关键作用，其中尤为引人注目的是NKG2D，NKG2D的配基为非经典的MHC样分子MICA(MHCclassⅠchain-relatedA)、MICB(MHCclassⅠchain-relatedB)及ULBP(UL16-bindingprotein)，这些分子在许多上皮及非上皮来源的肿瘤细胞、病毒感染细胞和受到“应激性刺激”的细胞均有表达或上调。研究表明，NKG2D的单独活化即足以刺激NK细胞的活化，并能克服抑制性受体的强势信号，因此，在NK细胞活化过程中起着举足轻重的作用。而NKG2D配体的表达水平，可能决定着NKG2D的活化与否。 目前世界上有六株细胞系被确认具有典型NK细胞标志，它们是：YT、NK-92、NKL、HANK-1、KHYG-1和NK-YS。这些细胞系的免疫表型为CD1-CD2+CD3-CD4-CD5-CD7+CD8。CD16-CD56+CD57-，具有NK活性，有/无ADCC效应。在这些细胞系中，YT细胞，来自一急性淋巴母细胞淋巴瘤和和胸腺瘤患者，1985年建系，为IL-2非依赖或低依赖细胞系，具有NK细胞的典型表面标志，但由于长期在实验室传代培养，只能检测到NKG2B和NKG2D的mRNA表达，而不能检测到其蛋白的表达。YT细胞相对于NK-92和NKL细胞而言，其杀伤活性相对较地低。该研究选用YT细胞作为NKG2B和NKG2D转染细胞的受体，来探讨NKG2B和NKG2D分子的作用机制。 方法:(1)NKG2B和NKG2D克隆载体的构建。从NK细胞系NK-92细胞中经RT-PCR技术获得NKG2BcDNA和NKG2DcDNA，与pGEM-TEasy连接及转化大肠杆菌后，构建NKG2B和NKG2D克隆载体，进行DNA序列测定;(2)NKG2B和NKG2D真核表达载体的构建。应用限制性内切酶将NKG2B和NKG2D基因从克隆载体上切下来，连接到荧光真核表达载体pEGFP-N1上，构建pGEM-TEasy/NKG2B和pGEM-TEasy/NKG2D真核表达载体;(3)真核表达载体在CHO细胞中的表达及鉴定。将筛选出的pEGFP-N1/NKG2B和pEGFP-N1/NKG2D质粒通过脂质体转染到CHO细胞中，经G418筛选，克隆，RT-PCR鉴定NKG2B和NKG2DmRNA的表达，荧光显微镜、WesternBlot和免疫组化方法鉴定NKG2B和NKG2D蛋白的表达;(4)真核表达载体转染YT细胞及对YT细胞生物学功能影响。将pEGFP-N1/NKG2B和pEGFP-N1/NKG2D质粒通过脂质体分别转染到YT细胞中，MTT方法检测YT细胞转染前后的增殖情况与对OMDA231、PG、Hep2和Raji肿瘤细胞的杀伤情况，RT-PCR技术检测杀伤相关分子中，抗病毒分子IFNγ、细胞增殖分子IL-2、溶膜分子perforin和诱导细胞凋亡分子家族TNF超家族(TNFα、Fas/FasL、TRAIL、TWEAK)的转录水平，并同时设置β-actin为RT-PCR系统的内参照。 结果: 一、NKG2B和NKG2D全长cDNA的克隆提取新鲜培养的NK-92细胞的总RNA，取5ug总RNA为模板，以oligo(dT)为引物进行逆转录反应。然后用NKG2B和NKG2D的特异引物进行PCR反应，PCR产物经电泳鉴定和与pGEM-TEasy载体连接、酶切鉴定后测序，证实已获得的cDNA为NKG2B和NKG2D的全长cDNA，结果与文献报道一致。 二、pEGFP-N1/NKG2B和pEGFP-N1/NKG2D重组表达载体的构建用PstⅠ和XhoⅠ从克隆载体pGEM-TEasy/NKG2B切下NKG2B片段，与经相同双酶切的pEGFP-N1质粒进行粘端连接；同样用EcoRⅠ和BamHⅠ从克隆载体pGEM-TEasy/NKG2D切下NKG2D片段，与经相同双酶切的pEGFP-N1质粒进行粘端连接。产物转化感受态大肠杆菌HB101，利用PCR筛选阳性克隆，提取纯化PCR阳性重组质粒进行双酶切鉴定，经PCR和双酶切鉴定阳性的克隆即为构建好的pEGFP-N1/NKG2B和pEGFP-N1/NKG2D重组表达载体。 三、NKG2B和NKG2D在CHO细胞中的表达应用脂质体法将构建好的pEGFP-N1/NKG2B和pEGFP-N1/NKG2D重组表达质粒分别转染CHO细胞，G418筛选培养基培养后，挑选抗性克隆，RT-PCR鉴定mRNA的表达，荧光显微镜下观察有绿色荧光发出、WesternBlot和免疫组化方法鉴定蛋白的表达。结果显示构建的pEGFP-N1/NKG2B和pEGFP-N1/NKG2D质粒能够转染CHO细胞并且有NKG2B和NKG2D的蛋白表达。 四、NKG2B和NKG2D真核表达载体转染YT细胞及对其生物学功能影响应用脂质体法将构建好的pEGFP-N1/NKG2B和pEGFP-N1/NKG2D重组表达质粒分别转染YT细胞，MTT方法测定转染前后的细胞增殖效应和对OMDA231、PG、Hep2和Raji肿瘤细胞的杀伤情况，RT-PCR技术检测杀伤功能相关分子的变化。结果显示YT细胞转染前后增殖效应没有变化；NKG2B转染YT细胞后对OMDA231、PG、Hep2细胞杀伤活性无变化，而对Raji有增强作用，杀伤相关分子IFNγ、FasL、TRAIL有明显降低。NKG2D转染YT细胞后对OMDA231、PG、Hep2和Raji细胞杀伤活性均有增强作用，杀伤相关分子IFNγ、IL-2、TNFα、Perforin、TWEAK有明显增强。 结论: (1)通过基因工程技术获得了全长的NKG2B和NKG2D基因片段，并且测序正确，成功构建了pEGFP-N1/NKG2B和pEGFP-N1/NKG2D真核表达载体。 (2)经转染CHO细胞后，能够在荧光显微镜下发出绿色荧光，RT-PCR检测出mRNA的表达，WesternBlot和免疫组化方法鉴定蛋白的表达。 (3)转染YT细胞，转染前后增殖效应没有变化；NKG2B转染YT细胞后对OMDA231、PG、Hep2细胞杀伤活性无变化，而杀伤相关分子IFNγ、FasL、TRAIL有明显降低。NKG2D转染YT细胞后对OMDA231、PG、Hep2和Raji细胞杀伤活性均有增强作用，杀伤相关分子IFNγ、IL-2、TNFα、Pefforin、TWEAK有明显增强。 (4)NKGB和NKG2D基因修饰YT细胞为使用NK细胞系进行细胞治疗奠定了理论和技术基础。 研究表明，YT细胞一方面可以作为基础研究的工具，用于研究NK细胞分化发育和对肿瘤细胞杀伤机理的探讨，阐明NKG2受体对NK细胞活性的调节机制，另一方面，通过基因修饰，可以有目的、有针对性地对NK细胞进行修饰，使得NK细胞更适合临床过继免疫治疗肿瘤的应用。