冠心病（Coronary Heart Disease,CHD）是冠状动脉粥样硬化性心脏病的简称,亦称为缺血性心脏病,是严重威胁人类身体健康的心血管疾病之一。冠心病是世界范围内的常见病和多发病,发病率和死亡率逐年上升,并且发病年龄具有年轻化的趋势。因此,冠心病的防治已成为医学界面临的一个重大问题。心肌缺血缺氧是冠心病的重要病理基础。冠心病属于中医学“心痛”“胸痹”的范畴。中医学认为,心脉失养、心血瘀阻是冠心病最主要的病机,冠心病气虚血瘀证成为临床最常见的证型,气虚为本,血瘀为标,发病过程多虚实相间,互相兼杂。益气活血方（YQHXF）是本课题组在古方补阳还五汤的基础上研制的配方颗粒剂,由益气药黄芪和活血药桃仁、红花、赤芍、川芎、当归、地龙组成。中药复方在治疗疾病上具有多环节、多靶点,多途径的优势,深入阐明复方益气活血的作用机理,明确中药的作用靶标,将为临床提供有力的依据和参考。近年来,线粒体在缺血性心血管疾病发展过程中扮演的角色受到越来越多的关注。线粒体是细胞能量代谢的中心,大部分能量由线粒体通过氧化磷酸化以ATP的形式提供,是高耗能心肌细胞ATP的主要来源。线粒体不仅是能量供应的场所,更是细胞信号转导中心,参与大量信号级联反应,调控细胞内钙稳态、ROS产生、细胞的凋亡和自噬等重要生物学功能,进而调节细胞的存活和死亡。缺血缺氧条件下会产生明显的氧化应激反应,线粒体通过电子传递体及氧化磷酸化过程产生ATP的同时也会产生大量活性氧（ROS）,过量的ROS又会反过来攻击细胞及亚细胞成分脂膜,引发脂质过氧化反应,破坏线粒体结构完整性。线粒体在呼吸氧化过程中,将产生的能量以电化学势能储存于线粒体内膜,在内膜两侧造成质子及其他离子浓度的不对称分布而形成线粒体膜电位AΨm,正常的膜电位是维持线粒体进行氧化磷酸化、产生ATP的先决条件,膜电位的稳定有利于维持细胞的正常生理功能,而膜电位的破坏是线粒体结构和功能损伤的重要指标,也是细胞凋亡过程中最早发生的事件。因此减少线粒体损伤,保护线粒体结构和功能的完整性对于保护心肌细胞损伤具有十分重要的意义。研究表明,受损的线粒体可以通过自噬-溶酶体途径特异性地进行降解,从而缓解因线粒体功能障碍而引起的细胞氧化应激损伤。这种特异性地通过自噬降解线粒体的途径则称为线粒体自噬。一般情况下,通过正常的线粒体自噬,细胞可降解并清除受损或功能障碍的线粒体,以维持细胞内线粒体质量和数量的平衡,保护细胞功能。但也有研究显示,过度的自噬也会促进心肌细胞损失。线粒体自噬除了清除受损的线粒体也会降解正常的线粒体,关键蛋白和细胞器的过度降解不利于细胞稳态的维持。一直以来,线粒体自噬在脑血管和神经退行性疾病中研究的较多,在心血管疾病方面研究较少,其对心脏功能保护作用的主要机制也并不明确。基于此,本研究将采用在体大鼠冠心病气虚血瘀证病证结合模型和H9C2心肌细胞系缺氧复氧损伤模型来研究益气活血方及其有效成分对心肌细胞的保护作用,并从线粒体自噬的角度探讨其对线粒体结构和功能的保护作用及机制。动物实验的主要研究内容及方法如下:1.建立大鼠冠心病气虚血瘀证病证结合模型,初步评价YQHXF对模型大鼠心肌的保护作用。主要实验方法为观察大鼠宏观体征,采集舌面色彩饱和度,采集脉搏搏动幅度,检测大鼠抓力等方面对大鼠进行中医证候评价;采用小动物超声仪采集大鼠超声心动图、ELISA法检测血清NT-proBNP、ALD、AngⅡ水平评价大鼠心功能;采用MASSON染色测定心肌梗死面积,HE染色光镜观察心肌组织病理学改变。2.在确定YQHXF抗心肌损伤作用的基础上,进一步考察YQHXF对心肌细胞线粒体结构和功能的影响。采用透射电镜观察线粒体超微结构及形态的改变;ELISA试剂盒检测血清ATP水平,初步评价其对线粒体功能损伤的影响。3.考察YQHXF对线粒体自噬水平的影响。采用免疫组化检测心肌PINK1,Parkin,HSP0蛋白表达水平,Western Blot实验检测PINK1,Parkin,Caspase3蛋白表达变化。依据复方组方特点和文献研究基础,选择黄芪甲苷（AS）和阿魏酸（FA）分别部分代表复方中益气药和活血药来进行细胞水平的实验研究,主要研究内容及方法如下:1.考察FA和AS对正常培养大鼠H9C2心肌细胞活力的影响。在此基础上,建立细胞缺氧复氧损伤模型,通过测定细胞活力以及TUNEL法测定细胞凋亡水平,Western Blot法检测Caspase3水平,初步明确二者对心肌细胞H/R损伤的保护作用。2.采用流式细胞仪分析心肌细胞中过氧化物ROS含量变化,化学发光法检测线粒体膜电位ΔΨm的改变,ADP/ATP试剂盒检测心肌细胞ATP水平,考察二者对线粒体功能的保护作用。3.采用荧光探针MitoTracker Green-LysoTracker Red共定位检测线粒体-溶酶体结合水平及免疫荧光法检测PINK1-HSP60和Parkin-HSP60共定位水平观察线粒体的数量及自噬程度,Western Blot法检测PINK1,Parkin,LCII,P62蛋白表达的变化,考察PINK1/Parkin通路对线粒体自噬的影响,并阐明其可能的作用机制。研究结果如下:1.YQHXF高剂量（349.2 mg·ml-1）组能够增加模型大鼠体重和抓力水平,升高舌面RGB值,提升脉搏幅度等中医证候水平;显著提升模型大鼠超声心动图EF、FS、LVIDd、LVIDs 指标,降低血清 NT-proBNP、ALD、AngⅡ含量。YQHXF 低剂量（174.6 mg·ml-1）组可以恢复模型大鼠体重和抓力水平,升高舌面RGB值,提高心脏射血分数EF;降低血清NT-proBNP、ALD、AngⅡ含量;对模型大鼠脉搏幅度以及心功能FS、LVIDd、LVIDs指标有一定改善,但无统计学意义。同时,YQHXF高低剂量组均能明显减少心肌损伤面积,减轻心肌细胞的变性、坏死及炎性细胞的浸润。2.对线粒体超微结构进行观察发现,YQHXF可以改善模型大鼠心肌线粒体肿胀,缓解内嵴结构的破裂,维持线粒体形态结构;同时,对大鼠血清ATP水平的测定显示,YQHXF可以提高机体ATP水平。3.对心肌组织进行免疫组化和免疫印记检测表明,YQHXF可以抑制线粒体自噬通路蛋白PINK1,Parkin的过度表达,增加线粒体基质蛋白HSP60的表达,减少凋亡蛋白caspase3的表达。4.AS和FA均能抑制H/R损伤造成的H9C2心肌细胞凋亡,保护心肌细胞损伤。5.AS和FA均能降低细胞ADP/ATP比率,恢复线粒体膜电位ΔΨm,降低ROS水平。6.AS和FA均能抑制线粒体-溶酶体的结合,增加线粒体基质蛋白HSP60的表达,抑制线粒体自噬通路蛋白PINK 1,Parkin的过度表达,增加P62蛋白以及抑制LC3 Ⅱ/LC3Ⅰ蛋白的表达。综上所述,本研究发现:1.YQHXF可以改善冠心病气虚血瘀证模型大鼠气虚和血瘀的中医证候表现,保护心脏功能。通过保护线粒体结构和功能,缓解心肌组织变性坏死,抑制心肌细胞凋亡,发挥保护冠心病气虚血瘀证病证结合大鼠缺血心肌的作用。2.YQHXF对冠心病气虚血瘀证模型大鼠心肌细胞的保护作用与维持线粒体结构与功能的完整,减轻线粒体损伤密切相关。3.YQHXF有效成分AS和FA均有显著的抗H9C2心肌细胞H/R损伤的作用,该作用是通过PINK1/Parkin途径抑制线粒体过度自噬,稳定线粒体数量,保护线粒体结构和功能,从而抑制细胞凋亡来发挥心肌保护作用。