研究背景:　　祖国医学认为，不孕症常与肾阳虚密切有关。testisin是一种糖基磷脂酰肌醇锚定的丝氨酸蛋白酶，首次发现在睾丸和附睾精子表面并在精子生成、附睾精子成熟和受精中起重要作用。尽管最近有研究显示，testisin可能参与精子在女性生殖道的获能、顶体反应以及受精等过程，但并没有研究报道testisin在女性生殖系统的作用。因此，我们假设testisin可能具有影响女性生殖系统的作用，并作为女性肾阳虚生殖功能下降的评价指标之一。为了验证我们的假设，我们首先建立肾阳虚生殖功能下降的动物模型，比较其子宫、卵巢、输卵管以及外周血testisin基因与正常动物的表达差异。其次，我们进一步比较了肾阳虚生殖功能下降的模型动物与使用温肾壮阳中药葫芦巴的模型动物testisin基因的表达，如果该基因表达有改善，则证明了该基因与肾阳虚生殖功能下降的关联。最后，我们检测了阳虚不孕患者testisin基因的表达，探讨testisin基因是否具有临床应用价值。　　一羟基脲建立肾阳虚小鼠模型及与testisin基因表达的研究　　目的:　　建立肾阳虚小鼠模型，观察其生殖系统是否有testisin基因表达以及与肾阳虚及生殖功能的关系。　　材料与方法:　　将49只雌性昆明小鼠随机分为造模组和对照组，造模组灌胃羟基脲造模，对照组灌胃生理盐水，连续灌胃9天。在造模期间，每日称重及阴道涂片，并隔日监测小鼠肛温。第10天将各组小鼠麻醉后行红外热成像（TTM）扫描子宫温度。此后，处死动物前收集其外周血样品，处死小鼠后收集其卵巢、子宫以及输卵管，称量卵巢湿重；一侧子宫、卵巢用于HE染色形态学观察，另一侧则进行组织裂解进行qRT-PCR分析，以检测testisin mRNA表达。同时，外周血细胞也用于qRT-PCR分析，检测testisin mRNA表达。最后，将剩余小鼠与雄性小鼠合笼，以观察受孕率。　　结果:　　羟基脲造模后，造模组小鼠表现出较典型的阳虚症状：为弓背蜷缩、竖毛而无光泽、挤卧、倦怠懒动、行动迟缓、眯眼嗜睡、肢尾凉、耳尾苍白、饮食及饮水量明显减少、大便溏；敲打笼盏时缓慢挪动或无明显反应、抓取时挣扎无力、易抓取；体重、肛温明显下降。此外，模型小鼠阴道分泌物表现出量增多、色透明且质清稀的特征，这是生殖系统典型的阳虚证表现之一。TTM扫描显示造模组小鼠子宫温度与对照组比较显著降低（P＜0.05），而造模组小鼠卵巢湿重/指数、卵泡数、子宫内膜厚度等均明显低于对照组（P＜0.05）；HE染色可见卵巢原始卵泡、初级卵泡、次级卵泡，但窦状卵泡、排卵前卵泡均较少，黄体形成较少或无。与雄鼠交配结果显示造模组小鼠受孕率为0％。与对照组比较，模型小鼠外周血细胞testisin mRNA表达显著减少（P＜0.05），而子宫testisin mRNA表达显著升高（P＜0.05）。但造模组卵巢和输卵管testisin mRNA表达与对照组比较无显著变化（P＞0.05）。　　结论:　　在本次实验中，我们提供了子宫、卵巢、输卵管以及外周血细胞中存在testisin基因表达的证据。与对照组比较，在肾阳虚模型小鼠子宫中testisin基因表达增加，而在外周血细胞中减少。这表明testisin基因可能与女性肾阳虚生殖功能下降相关联。　　二葫芦巴对羟基脲肾阳虚小鼠模型testisin基因表达及生殖功能的影响　　目的:　　进一步证实testisin基因的表达水平是否与肾阳虚生殖功能下降有关。　　材料与方法:　　将73只昆明雌性小鼠随机分为对照组（N=24）、造模组（N=25）、葫芦巴组（N=24），对照组灌胃生理盐水，造模组和葫芦巴组首先以羟基脲灌胃，持续9天。第10天，葫芦巴组以葫芦巴汤剂代替灌胃，持续7天。小鼠阳虚症状观察、样品收集和实验室检测均与第一部分实验所描述相同。　　结果:　　与造模组小鼠比较，葫芦巴组小鼠阳虚症状明显改善。TTM扫描显示葫芦巴组小鼠子宫温度明显升高（P＜0.05）；葫芦巴组小鼠卵巢湿重/指数、卵泡数、子宫内膜厚度等指标也均得以改善；葫芦巴组小鼠卵巢可观察到各级卵泡生长，其形态正常且有多个黄体形成；与造模组小鼠比较，葫芦巴组小鼠受孕率也显著提高至60%。qRT-PCR结果显示，葫芦巴组小鼠外周血细胞testisin基因表达较造模组小鼠显著上调（P＜0.05），而减少了子宫testisin基因的表达上调（P＜0.05）。　　结论:　　葫芦巴可明显改善肾阳虚模型小鼠阳虚症状，而且其testisin基因表达水平也向正常动物的表达水平恢复，这进一步验证了testisin与肾阳虚生殖功能下降的关联。　　三阳虚不孕患者外周血细胞testisin基因表达研究　　目的:　　检测临床阳虚不孕患者testisin基因表达，探讨testisin基因是否具有潜在的临床应用价值。　　材料与方法:　　将22例阳虚体质不孕患者作为研究对象，而6例正常健康人作为对照。收集外周血样品，采用qRT-PCR检测血细胞testisin基因的表达，实验室检测方法与第二部分实验所描述相同。　　结果:　　与对照组相比较，阳虚组外周血细胞testisin基因表达呈显著下调（P＜0.05）。　　结论:　　临床患者阳虚不孕证与肾阳虚伴生殖功能下降动物模型症状相似，其外周血细胞testisin基因表达的结果与实验动物模型结果一致，这表明该基因表达分析可用以诊断阳虚不孕证，并在临床治疗过程中具有潜在的临床应用价值。　　总结:　　通过以上实验研究表明:1）testisin基因在雌性小鼠生殖系统有表达；2）testisin基因表达可能与雌性小鼠肾阳虚证导致的生殖功能下降有关；3）testisin基因表达可能具有潜在的临床应用价值。然而需要进一步的临床研究来证实该基因临床应用的可行性。此外，该基因影响女性生殖的具体机制尚需更深入的研究。