流行性感冒主要是由流感病毒引起的、临床中常见的急性呼吸道传染病,多发生在春季。新出现的高致病性流感病毒具有高死亡率,同时具有较强的传染性,这在季节性流感爆发和大面积流行期间,严重威胁人类健康。近年来,由于流感病毒抗原的变异,临床中常用的抗流感病毒药物出现不同程度的耐药性和副作用,使得高致病性的禽流感在人类的传播导致感染人数和死亡人数不断增多。流感病毒的感染途径是通过飞沫传播,侵袭呼吸道粘膜,在呼吸道黏膜进行病毒复制和释放子病毒。流感病毒感染人体之初,呼吸道粘膜上的流感病毒载量较低,在此阻断流感病毒的侵袭是抑制流感病毒大量复制和释放病毒粒,限制严重感染的有效手段。接种有效的、安全的流感疫苗是预防流感和阻止流感大流行的主要手段。流感疫苗佐剂一直是疫苗研究领域的热点问题。疫苗佐剂在诱导免疫反应中的主要作用是提高机体免疫系统,提高抗原或者是免疫原的免疫应答反应。疫苗佐剂可以激活固有免疫反应以及提高抗原对免疫系统的递程和刺激作用,进而激活适应性免疫应答。本次试验通过冰香散挥发油滴鼻预防给药,检测流感病毒小鼠模型体内免疫水平,探讨冰香散挥发油抗流感病毒的免疫反应机制。同时,使用冰香散挥发油主要成分1,8-cineol作为流感疫苗佐剂,联合流感疫苗免疫小鼠,观察对不同亚型的流感病毒的预防作用,以其深入揭示1,8-cineol的佐剂活性,为其作为流感疫苗佐剂运用提供新的思路。研究目的通过冰香散挥发油滴鼻免疫,评价黏膜免疫对流感病毒感染鼠的治疗作用。同时,观察冰香散挥发油主要成分之一的1,8-cineol对流感病毒引起的病毒性肺炎炎症因子的变化情况;同时,1,8-cineol作为流感疫苗佐剂,联合流感疫苗,通过黏膜免疫,观察1,8-cineol联合流感疫苗对不同亚型的流感病毒的预防作用,并探讨其佐剂机制。研究方法实验一冰香散挥发油黏膜免疫抗流感病毒效果评价。1.采用流感病毒模型小鼠评价冰香散黏膜免疫抗流感作用。2.ELISA检测感染鼠的肺泡灌洗液和血清中的s-IgA、IgG,细胞因子IL-4、IFN-γ的表达。3.免疫组化检测鼻相关淋巴组织中CD4、CD8;4.采用细胞增殖与活性试剂盒(CCK-8)脾淋巴细胞增殖情况。实验二1,8-cineol对流感流感病毒引起的病毒性肺炎炎症因子的试验研究1.采用流感病毒模型小鼠评价1,8-cineol对病毒性肺炎的抑制作用。2.ELISA检测肺泡灌洗液中IL-6,TNF-α,IL-1β和IFN-y和鼻腔冲洗液中细胞因子MCP-1,IL-4,IL-5和IL-8水平。3.采用实时荧光定量PCR技术,观察流感病毒感染的小鼠模型中肺病毒载量的影响。4.HE染色观察感染小鼠肺部病理反应。5.采用WB检测肺部蛋白NF-κB,(VCAM)-1,ICAM-1的表达。实验三1,8-cineol作为流感疫苗佐剂黏膜免疫对流感病毒的预防作用研究1.采用流感病毒模型小鼠评价1,8-cineol的黏膜佐剂作用。2.采用实时荧光定量PCR技术,观察流感病毒感染的小鼠肺部病毒载量的含量。3.HE染色观察感染小鼠肺部病理反应。4.ELISA 检测血清中 s-IgA、IgG、IgG1b、IgG2a、IgG2b 水平。5.采用免疫组化检测呼吸道IEL的表达。6.采用流式细胞术检测外周血中CD40,CD80,CD86,CD11c的表达。研究结果1、冰香散挥发油通过滴鼻给药,能够提高流感病毒感染鼠的肺泡灌洗液和血清中s-IgA水平,与安慰剂组相比,有统计学意义(p<0.05);能够提高血清IgG含量,与安慰剂组相比,有统计学差异(p<0.05);与病毒唑相比,冰香散挥发油能够刺激CD4、CD8T细胞分化与成熟,能够刺激脾淋巴细胞增殖,刺激细胞因子IFN-γ、IL-4分泌。冰香散挥发油主要成分之一的1,8-cineol能够减轻流感病毒引起的病毒性肺炎的严重程度,有效提高感染小鼠的生存时间,降低鼻腔冲洗液和肺泡冲洗液中的炎症因子含量,抑制炎症反应中关键调节因子NF-κB,与模型对照组相比,具有统计学差异(p<0.05,p<0.01)。2、1,8-cineol联合流感疫苗预防接种,能够能降低感染鼠的肺指数,缓解流感病毒感染鼠的肺部病变程度,提高感染鼠的生存保护作用;提高血清中IgG,IgG1,IgG2a以及IgG2b的抗体水平,与单独疫苗组相比,具有统计学差异(p<0.05,p<0.01);1,8-cineol联合流感疫苗,能够有效诱导局部黏膜免疫反应,提高肺泡灌洗液中s-IgA的含量,提高呼吸道内皮上淋巴细胞IEL的表达,与单独疫苗组相比,具有统计学差异(p<0.05,p<0.01)。1,8-cineol联合流感疫苗,能够有效刺激树突状细胞的表达和成熟,促进共刺激信号的表达,与单独疫苗组相比,差异具有统计学意义(p<0.05,p<0.01)。结论冰香散挥发油通过滴鼻给药,能够有效诱导流感病毒感染鼠的黏膜免疫反应,激发细胞免疫和体液免疫,发挥抗流感病毒作用。冰香散挥发油的主要成分之一 1,8-cineol,可以抑制流感病毒导致的病毒性肺炎相关炎症因子的产生;同时,1,8-cineol作为流感疫苗佐剂,能够减轻流感病毒引起的肺部病理变化,能够抗击不同亚型的流感病毒,其可能机制主要是通过促进树突状细胞的数量和成熟,刺激共信号分子的表达,从而引起强烈的固有免疫和适应性免疫反应有关。