在植物中,淀粉是主要的储能物质。尽管其合成途径中的许多合成酶和调控因子都已经被很好地鉴定和研究。但是由于淀粉的生物合成是一个复杂且精细的过程,人类至今还无法在体外系统中合成淀粉,淀粉合成过程中还有许多环节是未知的,因此挖掘新的参与淀粉合成的因子并进行深入研究尤为重要。另一方面,淀粉是稻米籽粒最主要的组成成分,其含量和特性直接影响稻米的各项品质指标及最终适口性,同时淀粉的积累水平还可能影响水稻的产量,因此,深入研究水稻这一单子叶模式植物淀粉合成途径中的关键因子及调控网络具有重要的理论意义与应用价值。胚乳异常突变体主要包括糯性(waxy)、暗色(dull)、糖质(sugary)、皱缩(shrunk)、粉质(floury)等类型,这些突变体胚乳中正常的淀粉生物合成均受到影响,因此它们是研究水稻籽粒淀粉合成的理想材料。在本文的研究中,我们分析和鉴定了一个新的粉质突变体,命名为flo6 (floury endosperm 6)。通过图位克隆和转基因互补的手段,我们成功地克隆了FLO6基因,FLO6基因编码一个具有529个氨基酸的未知功能的蛋白。该蛋白在N端有一个质体定位信号肽,亚细胞定位研究证明它对于FLO6蛋白在质体中的正确定位起到关键作用,同时FLO6蛋白的C端有一个CBM48结构功能域,体外淀粉结合实验证明FLO6的这个功能域可以结合淀粉。另外,研究还发现FLO6可以与异淀粉酶ISA1互作,但是并不影响其活性,这些结果对进一步认识水稻胚乳中淀粉合成过程提供了帮助。主要研究结果如下：1.本研究通过筛选粳稻品种日本晴T-DNA插入突变体库,从中分离和鉴定了一个新的由组培变异引起的粉质突变体flo6。通过表型观察和生化分析发现,flo6突变体在整个胚乳发育过程中都显示出明显低于野生型的灌浆速率和淀粉含量。同时flo6突变体中淀粉的黏度特性、尿素的溶解特性、以及支链淀粉结构与野生型相比均发生改变,导致其产生了不同物理化学性质的新型淀粉。总的来说,flo6突变体胚乳中的淀粉合成从“质”和“量”上均发生了改变。这些结果说明FLO6基因对于水稻胚乳中淀粉合成是必须的。2.发育胚乳的细胞学分析结果显示,和野生型相比,flo6突变体胚乳细胞的胞质空间内存在大量零散分布的体积变小的淀粉颗粒,另外还发现了三种不正常的复合淀粉颗粒结构,这些不正常的复合淀粉颗粒结构从胚乳的中心区域到胚乳的外围区域均存在。这些结果说明FL06对于水稻胚乳中正常复合淀粉颗粒结构的形成是必不可少的。3.将flo6突变体与已测序的籼稻品种9311配制杂交组合,利用F2群体将突变基因定位在第三染色体长臂标记PC-12和PC-11之间26kb区间内,基因组测序发现基因Os03g0686900内部存在一个单碱基的插入,造成蛋白翻译提前终止。荧光定量PCR结果显示,该突变导致基因Os03g0686900在flo6突变体中表达下调。功能互补结果证实了Os03g0686900即为我们寻找的调控淀粉合成的目标基因,将其命名为FL06(Floury Endosperm6)。FL06基因编码一个包含529个氨基酸的未知功能的蛋白质。该蛋白在N端有一个质体定位信号肽,亚细胞定位研究证明它对于FL06蛋白在质体中的正确定位起到关键作用,同时FL06蛋白的C端有一个CBM48结构功能域,体外淀粉结合实验证明FL06的这个功能域可以帮助FL06蛋白结合淀粉。4.酵母双杂交实验发现FL06蛋白与异淀粉酶ISA1存在互作,而与其它淀粉合成酶无互作关系,同时这一结果得到了体内BiFC和体外pull-down实验的支持。进一步的淀粉同工酶活性电泳显示,在野生型和突变体的胚乳中脱分支酶(异淀粉酶和普鲁兰酶)、可溶性淀粉合成酶、质体磷酸化酶以及分支酶的活性均没有显著变化,暗示FL06基因的突变对于主要的淀粉合成酶的活性没有影响。同时我们的研究发现ISAl自身并不能直接结合淀粉,但是之前的研究表明ISAl在体内是可以绑定到淀粉颗粒上的,暗示ISAl在体内可能通过其它蛋白帮助结合到淀粉上。综合以上结果说明FL06可能作为一个“脚手架”蛋白通过与ISAl互作,来调控ISAl与淀粉的结合。