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目的:本课题研究拟以结肠癌细胞和构建结肠癌耐药细胞模型为基础,借助分子生物学及细胞生物学等先进技术,通过体外实验探讨氧化苦参碱对结肠癌细胞和结肠癌耐药细胞中TGF-β1/P38/PAI-1信号通路的干预作用,同时探索结肠癌上皮间质化（Epithelial-mesenchymal transition,EMT）对结肠癌耐药转移的作用机制,并以此来阐明氧化苦参碱逆转结肠癌EMT改变的分子机制及氧化苦参碱的抗肿瘤效用,为逆转结肠癌多药耐药提供新的研究方向。材料与方法:1.检测氧化苦参碱对于结肠癌细胞EMT的作用及迁移能力的影响。1.1对HT-29细胞和RKO细胞随机分组,以正常结肠上皮细胞FHC细胞作为对照组。使用Western blots方法分别检测各组细胞的EMT的相关标志物,包括上皮细胞标志物钙粘附蛋白E（E-cadherin）和间充质细胞标志物α平滑肌肌动蛋白（Alpha-smooth muscle actin,α-SMA）、纤连蛋白（fibronectin,FN）、纤溶酶原激活物抑制剂-1（Plasminogen Act ivat inhibitor-1,PAI-1）在内的蛋白表达。1.2分为氧化苦参碱+HT-29细胞组,氧化苦参碱+RKO细胞组,HT-29细胞组,RKO细胞组,然后使用CCK8法检测评估氧化苦参碱对于HT-29细胞和RKO细胞的增殖毒性。1.3分为氧化苦参碱+HT-29细胞组,氧化苦参碱+RKO细胞组,HT-29细胞组,RKO细胞组,然后使用划痕实验检测氧化苦参碱对HT-29细胞和RKO细胞迁移能力的作用。1.4为了揭示氧化苦参碱对于结肠癌RKO和HT-29细胞的作用机制,根据CCK8法所显示的浓度和剂量依赖性,选取了0.50 mg/ml氧化苦参碱作用24h以去除氧化苦参碱对于HT-29细胞和RKO细胞的细胞毒性作用。使用western blots方法检测了氧化苦参碱作用前后HT-29细胞和RKO细胞的E-cadherin和α-SMA的蛋白表达水平。同时由于EMT过程导致细胞外基质（extracellular matrix,ECM）的沉积,而ECM相关蛋白的聚集是肿瘤细胞迁移的一个关键因素。FN和PAI-1是ECM相关蛋白之一,在ECM积聚的过程中起着重要的作用。我们使用western blots方法检测了氧化苦参碱作用前后HT-29细胞和RKO细胞的FN和PAI-1的蛋白表达水平。2.构建结肠癌耐药细胞模型。2.1转基因法过表达转化生长因子-β1（transforming growth factor-β1,TGF-β1）构建结肠癌奥沙利铂耐药细胞系HT-29/L-OHP。按照引物设计原则设计引物,利用划痕法接种大肠杆菌,CaCl2法制备感受态细菌,转化重组质粒DNA,利用含有卡那霉素（Kanamycin,kan）的琼脂平板筛选含有重组质粒DNA的菌株,利用抽提试剂盒进行少量抽提重组质粒DNA,并对阳性的抽提质粒酶切后进行PCR验证以及送invitrogen公司测序验证。验证成功后,利用抽提试剂盒进行中量抽提重组质粒DNA,经过大规模转化回收后,利用脂质体2000介导进行转染。2.2浓度梯度法构建结肠癌奥沙利铂耐药细胞系HT-29/NL-OHP耐药细胞模型。使奥沙利铂浓度为5μmol/L（1/3 IC50）,当细胞再次呈对数生长时,继续培养2至3个星期,然后进行细胞传代,将奥沙利铂浓度提高至8μmol/L。然后按照11μmol/L、13μmol/L、15μmol/L的顺序依次提高奥沙利铂的浓度。细胞不再呈对数生长,终止培养。2.3分别用荧光显微镜和普通显微镜观察HT-29/L-OHP和HT-29/NL-OHP两种耐药细胞的形态以及转基因法构建的细胞的转染情况。2.4利用CCK8法检测奥沙利铂对于HT-29/L-OHP和HT-29/NL-OHP两种耐药细胞模型的增殖抑制率,以亲本细胞HT-29为对照组,通过计算IC50来对耐药率进行计算。2.5利用CCK8法检测5-氟尿嘧啶对于HT-29/L-OHP和HT-29/NL-OHP两种耐药细胞模型的增殖抑制率,以亲本细胞HT-29为对照组,通过计算IC50来对耐药率进行计算。2.6利用CCK8法检测伊立替康对于HT-29/L-OHP和HT-29/NL-OHP两种耐药细胞模型的增殖抑制率,以亲本细胞HT-29为对照组,通过计算IC50来对耐药率进行计算。2.7我们利用western blots来检测耐药细胞HT-29/L-OHP中的上皮细胞标志物（E-cadherin）和间充质细胞标志物（α-SMA,FN,PAI-1）的变化,以HT-29细胞为对照组,从蛋白水平证实耐药过程中是否发生EMT改变。2.8以结肠癌HT-29细胞为对照组,利用Transwell侵袭和迁移实验来检测耐药细胞HT-29/L-OHP在形态水平和蛋白水平发生EMT改变是否会导致细胞侵袭和迁移功能的改变。2.9 TGF-β1信号通路是控制EMT变化的主要信号通路之一,我们以亲本HT-29细胞为对照组,利用Western blot法检测耐药细胞中TGFβ1/Smad2信号通路的上关键蛋白TGF-β1、Smad2、Smad4和P38的表达情况来验证是否被激活。2.10为了验证P38对于TGFβ1信号通路控制结肠癌EMT改变的重要作用,我们使用了P38阻断剂SB203580,然后用western blots方法检测添加阻断剂前后耐药细胞HT-29/L-OHP中Smad2和Smad4蛋白表达水平的变化情况。3.检测氧化苦参碱逆转结肠癌EMT及耐药的作用。3.1将细胞进行分组:氧化苦参碱联合奥沙利铂组、单独使用奥沙利铂组,氧化苦参碱联合5-氟尿嘧啶组、单独使用5-氟尿嘧啶组,氧化苦参碱联合伊立替康组、单独使用伊立替康组,分组后利用CCK8法检测各组细胞的增殖率,计算氧化苦参碱对于耐药细胞HT-29/L-OHP的奥沙利铂、5-氟尿嘧啶、伊立替康耐药逆转率。3.2我们以HT-29细胞为对照组,利用transwell迁移实验来检测氧化苦参碱对于耐药细胞HT-29/L-OHP迁移潜力的影响。3.3在不同浓度的氧化苦参碱作用耐药细胞HT-29/L-OHP后,我们利用western blots方法检测TGF-β1/P38/PAI-1信号通路上关键蛋白的表达水平变化情况。3.4构建pEGFP-TGF-β1-shRNA重组质粒,利用脂质体2000将重组质粒转染进入耐药细胞HT-29/L-OHP中,转染后使用荧光显微镜观察转染效果。3.5为了明确EMT发生的分子机制,我们利用Western blots和RT-PCR技术对比检测耐药细胞HT-29/L-OHP和亲本细胞HT-29中的PAI-1蛋白表达和mRNA表达情况。另外我们将构建好的重组质粒pEGFP-TGF-β1-1-shRNA和pEGFP-TGF-β1-2-shRNA转染进入耐药细胞干扰TGF-β1mRNA表达后,通过Western blots和RT-PCR分别检测各组细胞的PAI-1蛋白表达和mRNA表达情况。3.6将构建好的重组质粒pEGFP-TGF-β1-1-shRNA转染进入耐药细胞HT-29/L-OHP中干扰TGF-β1mRNA表达,利用CCK8法测定加入氧化苦参碱前后,奥沙利铂对结肠癌耐药细胞的细胞增殖抑制率的变化。然后使用P38阻断剂阻断P38蛋白表达,观察奥沙利铂对结肠癌耐药细胞的细胞增殖抑制率的变化。结果:1.检测氧化苦参碱对于结肠癌细胞EMT的作用及迁移能力的影响。1.1与正常结肠上皮FHC细胞相比较,结肠癌细胞HT-29和RKO细胞的上皮细胞标志物（E-cadherin）蛋白表达明显降低,甚至消失,而间充质细胞标志物（α-SMA,FN,PAI-1）蛋白表达升高。1.2氧化苦参碱对HT-29细胞和RKO细胞的增殖抑制作用呈现时间和剂量依赖型。1.3在24小时后,添加氧化苦参碱的RKO细胞和HT-29细胞的划痕间距明显大于未添加氧化苦参碱的癌细胞（P<0.05）,HT-29细胞和RKO细胞的迁移能力受到氧化苦参碱的抑制。1.4在使用了0.50 mg/mL氧化苦参碱作用于HT-29细胞和RKO细胞后,与未使用氧化苦参碱的HT-29细胞和RKO细胞相比,上皮组织标志物E-cadherin的蛋白表达水平被提升,而间充质标志物α–SMA蛋白表达水平被调低（P<0.05）。1.5与对照组相比较,0.50 mg/mL氧化苦参碱的治疗可以抑制FN和PAI-1升高的蛋白表达水平（P<0.05）。2.构建结肠癌耐药细胞模型。2.1 pEGFP-TGF-β1转染HT-29细胞后RT-PCR结果显示出两排光亮条带,一排条带为β-actin 331bp,另一排条带为TGF-β1 479bp,另外空染组和对照组的TGF-β1条带的亮度明显强于TGF-β1基因干扰组（TGF-β1-1组、TGF-β1-2组）,说明过表达基因后TGF-β1mRNA水平明显升高,同时也证明了pEGFP-TGF-β1成功转染进入HT-29细胞。2.2在显微镜下观察,通过转基因法构建的耐药细胞株HT-29/L-OHP和常规浓度梯度法构建的耐药细胞株HT-29/NL-OHP均呈纺锤状或梭形,细胞孤立,细胞间连接减少甚至消失,常有伪足伸出。这与亲本细胞HT-29呈椭圆形或不规则的多边形的形态完全不同。2.3奥沙利铂对两种耐药细胞HT-29/L-OHP和HT-29/NL-OHP的细胞增殖抑制率明显低于与正常结肠癌HT-29细胞,耐药指数分别为11.14和11.64,说明结肠癌耐药细胞模型构建成功。2.4 5-氟尿嘧啶及伊立替康对耐药细胞HT-29/L-OHP的细胞增殖抑制率明显低于与正常结肠癌HT-29细胞,耐药指数为3.5和7.91,说明耐药细胞HT-29/L-OHP对5-氟尿嘧啶和伊立替康同样具有耐药性,为多药耐药模型。2.5与结肠癌细胞HT-29相比,耐药细胞HT-29/L-OHP中间充质标志物α-SMA、FN、PAI-1蛋白表达水平明显高于对照组,而上皮标志物E-cadherin蛋白表达水平下调。2.6在transwell侵袭和迁移实验当中,耐药细胞HT-29/L-OHP组在微孔膜上的细胞数要明显多于结肠癌细胞HT-29组,分别为1.9倍和2倍。2.7与亲本细胞HT-29细胞相比,耐药细胞HT-29/L-OHP细胞中的TGF-β1、Smad2和Smad4的蛋白表达明细增高,同时P38蛋白HT-29/L-OHP也成正比例增加。2.8在耐药细胞HT-29/L-OHP中,P38阻断剂SB203580可以抑制TGF-β1所致的Smad2和Smad4的蛋白表达水平升高。3.检测氧化苦参碱逆转结肠癌EMT及耐药的作用。3.1与单独使用奥沙利铂相比,加入氧化苦参碱后,奥沙利铂对于耐药细胞HT-29/L-OHP的增殖抑制率明显提升,耐药逆转指数为4.84。同样,氧化苦参碱的5-氟尿嘧啶和伊立替康的耐药逆转指数为2.41和4.93。3.2与耐药细胞HT-29/L-OHP相比,加入氧化苦参碱后,耐药细胞HT-29/L-OHP的细胞穿透transwell膜发生迁移的数目明显减少,相差1.8倍。3.3显示随着氧化苦参碱作用浓度的增加,上皮细胞标志物E-cadherin蛋白表达逐渐增强,而间充质标志物PAI-1蛋白表达逐渐减弱。3.4重组质粒pEGFP-TGF-β1-shRNA转染耐药细胞HT-29/L-OHP后RT-PCR结果显示空染组和对照组的TGF-β1条带的亮度明显强于TGF-β1基因干扰组（TGF-β1-1组、TGF-β1-2组）,说明RNA干扰后TGF-β1基因被明显降解。3.5 RNA干扰组的细胞形状由梭形或纺锤形转变为不规则的多边形或是圆形,接近于正常非耐药的结肠癌细胞,而空染组的细胞仍然为梭形或是纺锤形,与耐药细胞形状相同。3.6干扰耐药细胞TGF-β1mRNA表达后,与空转染组及对照组（未做任何处置的HT-29/L-OHP耐药细胞）相比,PAI-1的蛋白表达水平和mRNA水平明显下降。3.7耐药细胞中TGF-β1被干扰后,加入氧化苦参碱前后,奥沙利铂对耐药细胞的增殖抑制率无明显变化。同样,P38被阻断后,加入氧化苦参碱前后,奥沙利铂对耐药细胞的增殖抑制率无明显变化。结论:1.氧化苦参碱能够抑制结肠癌细胞增殖和迁移,伴随着PAI-1和FN蛋白表达的调低,可能通过抑制PAI-1和FN的蛋白表达来逆转结肠癌细胞EMT改变而实现抗癌效果的。2.TGF-β1基因及其通过TGFβ1/P38/Smad2信号通路引起的EMT改变是结肠癌细胞产生耐药性的分子机制之一。3.氧化苦参碱能够逆转结肠癌耐药,并呈现浓度依赖型,并利用基因转染等技术证实这种作用极有可能是通过作用于TGF-β1/P38/PAI-1信号通路逆转结肠癌EMT改变来实现的。