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【背景和目的】：恶性肿瘤是人类最常见的死因之一，随着诊疗技术的不断提高，肿瘤患者的总体生存率有了显著提高，但对于一部分肿瘤患者，如大肠癌、肺癌等，生存率的改善仍不明显，需要进一步寻找新的治疗方法。肿瘤生物治疗是目前肿瘤治疗的研究热点之一，溶瘤病毒是利用突变病毒基因或利用肿瘤特异性启动子控制病毒肿瘤特异性复制，进而达到选择性杀伤肿瘤细胞的一类病毒。目前已用月中瘤特异性启动子构建了多种溶瘤病毒，但是由于在这些载体中运用了组织特异性的启动子，它们的抗肿瘤范围被限制在特定种类的癌症，不具广谱抗肿瘤性。端粒酶是染色体末端复制时所需的一种酶，它在85％以上的肿瘤细胞中是活性增高的，而在绝大多数体细胞中是失活的，这提示端粒酶启动子在肿瘤靶向性生物治疗中具有良好的应用价值。基于以上原理，我们构建了hTERT（human telomerase reverse transcriptase）启动子驱动E1基因和GFP基因表达的腺病毒载体Ad／hTERT-GFP-E1，以达到肿瘤特异性复制和肿瘤靶向性治疗的目的。在本实验中我们将选用多种大肠癌细胞，通过测定细胞活力来检验该腺病毒载体在体外的抗肿瘤作用，并探讨其抗肿瘤的机制及进一步的应用。【实验方法】：用293细胞扩增各重组腺病毒，通过氯化铯密度梯度离心法纯化腺病毒；TCID50法测定病毒滴度及其体外复制能力：荧光显微镜下观察细胞GFP的表达；MTT法及细胞克隆形成试验检验该病毒在体外对肿瘤细胞及正常细胞的杀伤作用；用原位细胞凋亡试剂盒对病毒感染后的细胞行凋亡检测，各处理组间的差异采用配对的t检验来评估。【结果】：1)、腺病毒体外复制能力的测定：用Ad／hTERT-GFP-E1及Ad／CMV-GFP感染DLDl细胞48h后，在光镜下见Ad／hTERT-GFP-E1感染的DLD1细胞出现细胞病变效应（Cytopathic Effect CPE），在荧光显微镜下观察到有明显的GFP表达，感染了Ad／CMV-GFP的DLD1细胞中也可见GFP表达，但细胞形态无明显变化，而感染这两种病毒的正常人成纤维细胞（Normal Human Fibroblast，NHFB）细胞未见任何CPE且仅见极少量的GFP表达；一周后取以上细胞裂解液感染DLD1细胞，结果显示用感染Ad／hTERT-GFP-E1的DLD1裂解液再次感染48h后仍可见明显的CPE及GFP表达，而其他的细胞裂解液均未造成类似的效果。对上述裂解液进行TCID50测定后结果表明DLD1细胞感染Ad／hTERT-GFP-E1的裂解液后病毒滴度明显高于感染Ad／CMV-GFP的裂解液，而在NHFB细胞分别感染上述两种病毒的裂解液后病毒滴度无明显差异。2)、溶瘤病毒对大肠癌细胞的体外杀伤作用：选择不同滴度的病毒感染正常细胞（NHFB）及大肠癌细胞（DLD1、HCT8、LOVO、SW116、HCT116），5天后MTT法测定其细胞活力，结果表明Ad／hTERT-GFP-E1对NHFB没有杀伤作用，而对大肠癌细胞均有明显的杀伤作用，而且杀伤作用与病毒浓度存在剂量依赖关系，Ad／CMV-GFP对以上肿瘤细胞都无明显的抑制作用；用250MOI的两种病毒分别感染LOVO和NHFB后，在第3、5、7、9天测定细胞活力，结果显示Ad／hTERT-GFP-E1对LOVO的杀伤作用随作用时间增加而增强，而NHFB细胞的相对活力与感染时间不存在相关性；细胞克隆形成试验结果也显示Ad／hTERT-GFP-E1能够显著抑制肿瘤细胞克隆形成，该抑制作用存在剂量依赖关系。3)、凋亡检测：分别用500MOI的Ad／hTERT-GFP-E1及Ad／CMV-GFP感染DLD1细胞48小时后用原位细胞凋亡试剂盒进行凋亡检测，结果显示Ad／hTERT-GFP-E1作用后细胞凋亡率较Ad／CMV-GFP及PBS处理后明显增加，细胞计数后的结果显示：PBS组、Ad／CMV-GFP组、Ad／hTERT-GFP-E1组的凋亡率为分别为1.44±0.15％、1.75±0.47％、10.75±1.24％，Ad／hTERT-GFP-E1所引起的凋亡率显著高于其他两个对照组（P＜0.01）。【结论】：1)、溶瘤腺病毒Ad／hTERT-GFP-E1能够选择性地在肿瘤细胞内复制，并且能够在长时间内维持较高的病毒滴度；2)、Ad／hTERT-GFP-E1能够选择性地杀伤肿瘤细胞，而对人正常纤维细胞都没有毒性作用；3)、溶瘤病毒杀伤肿瘤细胞的机制与细胞凋亡的途径有关。