冬凌草挥发油有效成分治疗胃癌的关键靶点及分子机制研究

来源 :南京中医药大学 | 被引量 : 0次 | 上传用户:jingjing17_
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背景:胃癌(Gastric cancer,GC)是全球最常见的恶性肿瘤之一,严重威胁人类健康。现代研究表明,中草药中所含各类化学成分均有抗肿瘤作用。通过对临床涉及中药复方进行挖掘分析,选择合适的中药深入研究,探索分析其抗胃癌的分子机制,为胃癌的临床治疗提供理论基础,为治疗胃癌的新药开发提供参考。目的:探讨治疗胃癌处方的组方用药规律,分析清热解毒类中药在胃癌中医治疗中的价值,选定目标中药,利用网络药理学分析方法结合肿瘤数据库挖掘技术对中药冬凌草(目标中药)挥发油有效成分在胃癌中的药理作用做初步研究,利用分子生物学实验对其进行初步实验验证,以期为中药冬凌草在临床中的使用提供参考依据。(1)筛选冬凌草挥发油有效成分治疗胃癌的关键靶点,构建一个“中药-化合物-靶点-疾病”调控网络。(2)验证关键靶点在胃癌组织中的表达情况,探究中药冬凌草治疗胃癌的分子机制。方法:(1)通过整理近年来胃癌临床治疗中涉及的中药处方,建立数据库并进行频次、中药类别、四气五味归经统计,应用IBM SPSS Statistics 21予以聚类及因子分析;分析临床常用的清热解毒类中药,筛选目标中药,进行临床价值分析。(2)利用GE02R工具分析GEO数据库中胃癌芯片数据集,筛选胃癌差异基因(DEGs);利用在线工具Metascape分析上述DEGs的GO和KEGG富集;同时利用String数据库结合Cytoscape软件构建DEGs的相互作用网络,并筛选在互作网络中评分较高的差异基因,从而进一步探索胃癌的发生发展机制;利用GEPIA在线工具对上述差异基因对胃癌患者的生存相关性进行分析,识别胃癌中的关键基因。(3)基于网络药理学的研究策略,使用己发表研究、TCMSP、SwissTargetPrediction和Pharmapper等资源平台预测冬凌草挥发油有效成分的潜在靶点,以第二章分析的胃癌关键基因集作为疾病靶点,通过蛋白质相互作用网络预测冬凌草挥发油有效成分治疗胃癌的网络调控机制。(4)为进一步验证网络药理学研究发现的干预机制,首先通过IHC法测定胃癌组织及癌旁组织中TNF-α、IL-1β、MMP9和PTGS2四个蛋白的表达量;接下来使用不同浓度的冬凌草挥发油对胃癌细胞进行处理,探讨冬凌草挥发油有效成分对胃癌细胞生长的作用及对下游靶点蛋白和mRNA表达水平的影响,分析冬凌草挥发油有效成分抑制胃癌细胞的具体分子机制和作用靶点。结果:(1)纳入分析的128份处方中涉及中药260种,共计1153次;使用频次前5位的中药分别为白术、白花蛇舌草、黄芪、茯苓、半夏;居于中药类别频率前5位的分别为补气药、清热解毒药、利水渗湿药、化瘀止血药、理气药;中医处方治疗胃癌上述高频中药的药物以温性(257次,37.62%)及寒性(242次,35.43%)为主,甘味药(329次,48.17%)使用频次最高,药物归经分布规律为脾肺胃三经最多;聚类分析将上述高频中药归为10类;因子分析显示可提取出8个公因子,累积贡献率为66.4%;清热解毒类高频药物包括:白花蛇舌草、半枝莲、冬凌草及藤梨根;刘尚义教授所开248例方剂,冬凌草使用频次达210次,位列第三;刘启泉教授所开方剂涉及155味中药,其中冬凌草频次达70次,频次排名位列第一。选择冬凌草作为目标中药进行后续研究。(2)GEO数据库筛选胃癌差异基因,得到胃癌差异基因751个;GO及KEGG富集分析,从分子功能、生物过程、细胞组分及信号通路方面分析差异基因与胃癌发生发展相关的特征;成功构建751个差异基因的PPI网络,并筛选出TOP50的差异基因;生存分析显示,COL1A1、TIMP3与患者总生存期(OS)显著相关,而只有TIMP3与患者无病生存率(disease free survival,DFS)相关。(3)经ADME预测分析冬凌草挥发油成分结果中我们筛选出具有药理学活性成分13个,并通过与胃癌的83个共有靶点,成功构建了一个“中药-化合物-靶点-疾病”网络;KEGG信号通路富集到148条(p<0.05),GO分析得到主要生物过程有1926个,细胞组成有26个,分子功能有83个(p<0.05),并以此预测了冬凌草挥发油有效成分对胃癌的作用机制;经String平台与Cytoscape 3.7.2软件深入分析得到4个核心靶点:TNF-α、IL-1β、MMP9和PTGS2,并通过反向探查找到冬凌草挥发油成分核心物质:油酸、棕榈油酸、桃醛、9-癸烯酸、3,5-二叔丁基苯酚。(4)IHC法测定结果发现胃癌组织中TNF-α、IL-1β、MMP9和PTGS2的表达量明显比癌旁组织高;CCK-8结果显示,冬凌草挥发油有效成分以不同浓度刺激胃癌MKN-45和HGC-27细胞株后,细胞抑制率显著增加,呈浓度依赖性地抑制胃癌细胞的活性;流式细胞凋亡检测显示,冬凌草挥发油有效成分低剂量组和高剂量组的细胞凋亡率显著高于对照组,并且高剂量组的细胞凋亡率明显高于低剂量组;Western Blot和RT-PCR实验发现,冬凌草挥发油有效成分低剂量组和高剂量组的TNF-α、IL-1β、MMP9和PTGS2蛋白和mRNA的表达水平均明显低于对照组,并且高剂量组又显著低于低剂量组。结论:冬凌草含有多种对胃癌有抑制作用的挥发油有效成分;网络药理学及生物信息学分析得出冬凌草挥发油有效成分作用于胃癌的核心靶点可能为:TNF-α、IL-1β、MMP9和PTGS2;TNF-α、IL-1β、MMP9和PTGS2蛋白在胃癌组织中的表达显著高于癌旁组织;冬凌草挥发油有效成分能有效抑制MKN-45及HGC-27细胞增殖,诱导凋亡,抑制TNF-α、IL-1β、MMP9和PTGS2蛋白及mRNA的表达水平。
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