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脂肪细胞内甘油三酯的水解对机体能量代谢有着重要影响。脂解的平衡不仅可以有效地为机体提供能量,而且可以防止因体脂过度沉积引发的肥胖以及胰岛素抵抗等一系列代谢性疾病,因此对脂解的调控研究十分关键。脂肪分解酶是脂解反应中的关键因素。甘油三酯水解酶(TGH)是继激素敏感脂酶(HSL)之后发现的又一脂肪分解关键酶。以往对于TGH的功能研究主要集中于啮齿类动物,有关哺乳动物中TGH的脂解作用研究尚未见报道;TGH是和HSL一样是在激素刺激作用下发挥作用,还是主要介导基础状态下的脂解,目前尚不明确。因此,本实验以与人类生理生化方面最为相似的猪为模式动物,利用细胞培养、甘油三酯含量检测、甘油释放量测定,半定量RT-PCR、Western-Blot以及载体构建等细胞生物学和分子生物学技术研究了TGH在猪原代脂肪细胞分化中的表达规律以及细胞饥饿和重新恢复营养状态下的脂解及TGH的表达变化;并且通过在异丙肾上腺素刺激作用下与HSL的对比,初步探讨了其在脂肪分解中的作用方式;此外,构建了TGH的RNA干扰载体,为实验室以后进一步研究TGH的功能作出铺垫。所取得的结果如下: 1检测了猪原代脂肪细胞分化过程中TGH的表达。TGH mRNA在前脂肪细胞不表达,在诱导分化第4天表达量最高,之后表达量相对稳定,到第10天表达量略有下降。TGH的蛋白表达和其mRNA表达不尽相同,TGH蛋白在第0天几乎不表达,第二天表达量较低,第六天表达量最高,随后表达有所降低,然后基本趋于稳定。2检测了细胞饥饿及重新恢复营养状况下脂肪分解的变化及TGH的表达改变,分析该过程中TGH的作用。细胞缺乏营养状态下,即用无糖无血清培养基培养时甘油释放量升高,即脂解作用增强,同时TGHmRNA和蛋白表达与对照相比升高;当恢复营养(完全培养基培养)后其表达又有所下降,但脂解下降不显著。3研究了异丙肾上腺素(Isoproterenol)刺激状态下脂肪分解及TGH的表达变化,并分析该状态下TGH的作用。低浓度的异丙肾上腺素(0.1μmol/L,1μmol/L)没有检测到脂肪细胞释放到培养基中的甘油含量的改变,随异丙肾上腺素浓度的升高,甘油释放量显著上升,同时检测到细胞中甘油三酯含量下降,即脂解作用增强。此过程中HSL mRNA及蛋白表达均随异丙肾上腺素浓度的升高以及作用时间的不同而呈剂量和时间依赖性改变,但TGHmRNA和蛋白的表达在此过程中没有显著变化。4构建了pSilencer-TGH载体并筛选了潮霉素的最佳致死浓度。对原质粒进行酶切、回收,连接、转化、质粒提取,最后测序鉴定表明TGH RNA干扰载体已经构建成功。200μg/mL是潮霉素抗性筛选的最佳浓度。