2型糖尿病（type2diabetes mellitus，DM）是由于胰岛素相对缺乏或胰岛素抵抗（insulin resistance，IR）而引起的代谢紊乱性疾病，可导致多器官功能损害。近年来，其发病率逐年升高，已成为严重威胁人们健康的全球性疾病。因此，深入了解其发病机制，对于2型糖尿病的预防及治疗有着重要意义。脂肪酸代谢紊乱已被公认为是2型糖尿病的一个重要特征，2型糖尿病时，各种脂肪酸，尤其是多不饱和脂肪酸，如何改变？与2型糖尿病的关系如何？却研究甚少。相关基因的单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphism，SNP）是从基因水平影响体内脂肪酸代谢的重要因素，并且与2型糖尿病的发生发展密切相关。有研究表明，为多不饱和脂肪酸合成过程中关键酶，△5去饱和酶（△5desaturase，△5D）和△6去饱和酶（△6desaturase，△6D）编码的基因---脂肪酸去饱和酶1（fatty acid desaturase1，FADS1）和2（FADS2）基因的SNPs突变与体内脂肪酸关系密切，那么FADS基因簇的SNP突变是否与2型糖尿病时脂肪酸代谢紊乱有关？而且，除了基因多态性能够影响体内脂肪酸代谢以外，体内参与脂肪酸代谢的相关酶的表达及活性也是影响脂肪酸代谢的重要因素。肝脏是体内脂肪酸合成的主要器官，也是为肝外组织提供脂肪酸的主要器官。2型糖尿病时，肝脏脂肪酸的合成又会发生哪些改变？与2型糖尿病时的脂肪酸代谢紊乱关系如何？值得进一步研究。因此，本研究首先对2型糖尿病患者血清中脂肪酸谱进行检测及分析，以了解2型糖尿病患者体内脂肪酸变化情况，选出与2型糖尿病关系密切的脂肪酸作为研究的靶点，从基因水平以及肝脏对脂肪酸合成影响角度深入探讨2型糖尿病时脂肪酸代谢紊乱的机制，为2型糖尿病的预防和治疗提供有力的实验证据。第一部分2型糖尿病患者血清脂肪酸谱分析目的：了解2型糖尿病患者体内脂肪酸代谢改变情况，为研究2型糖尿病时脂肪酸代谢紊乱机制寻找靶点。方法：选择符合条件的研究对象共752例，按照病例对照研究分组（健康人421例，2型糖尿病患者331例），收集空腹血清，测定空腹血糖（fastingblood glucose, FBG）、胰岛素（fasting insulin, FINs）、甘油三酯（triglycerides,TGs）、胆固醇（total cholesterol, TC）及总游离脂肪酸（free fatty acids,FFAs），计算体重指数（body mass index, BMI）；用高效气相色谱法测定所有受试者空腹血清中主要的14种脂肪酸，并进行分类分析，以了解2型糖尿病患者体内脂肪酸代谢情况。结果：1一般情况及生化指标2型糖尿病（DM组）与健康非糖尿病组（Con组）的性别比例一致，没有差异。与Con组相比，DM组的年龄64(10) vs.51.38(18)，明显高于Con组，P<0.001；DM组的BMI（25.568±3.316vs.23.177±2.434）同样明显增加，P<0.001。与Con组相比，DM组FBG、FINs、TC及TGs均明显增高，P<0.001；通过公式计算得DM组的胰岛素敏感指数（insulin sensitive index, ISI）明显下降，而胰岛素抵抗指数（HOMA-IR）则明显增加，P<0.001。血清总FFAs明显增加，（403.39±82.54μmol/L vs.658.62±125.75μmol/L），P<0.001。2血清脂肪酸谱脂肪酸谱显示：与Con相比，DM组血清中C16:0、C16:1n-7、C18:1n-9、C18:3n-3（α-linolenic acid, ALA）、C20:5n-3（eicosapentaenoic acid, EPA）、C22:5n-3（docosapentaenoic acid, DPA）及C20:4n-6（arachidonic acid, AA）百分含量明显增加，P<0.01；C18:0、C24:0、C22:6n-3（docosahexenoic acid,DHA）和C18:2n-6（linoleic acid, LA）的百分含量明显下降，P<0.01；只有C20:0、C22:0和C22:4n-6变化不明显。对各种脂肪酸进行归类分析，发现：与Con组相比，DM组的总单不饱和脂肪酸（monounsaturated fatty acids，MUFAs）所占比例明显升高，P<0.01；而总饱和脂肪酸（saturated fatty acid, SFAs），总n-3系多不饱和脂肪酸（polyunsaturated fatty acids，n-3PUFAs）和总n-6系多不饱和脂肪酸（n-6PUFAs）均没有明显变化。小结：12型糖尿病患者体内总游离脂肪酸增加。22型糖尿病患者血清脂肪酸谱发生明显改变，AA含量明显增加，DHA的含量明显下降。第二部分FADS1-FADS2基因簇单核苷酸多态性与血清PUFAs、去饱和酶活性及2型糖尿病的关联性研究目的：探讨FADS1-FADS2基因簇的单核苷酸多态性（single nucleotidepolymorphism, SNP）与2型糖尿病患者血清PUFAs及2型糖尿病之间的相关性。方法：选择符合条件的研究对象752例（入选和排除标准同第一部分研究），收集外周血，提取DNA，用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（Matrix Assisted Laser Desorption/ionization Time of Flight MassSpectrometry，MALDI-TOF MS）实验平台进行DNA的SNPs分型。用非条件Logistic回归逐一分别在未校正混杂因素；校正性别和年龄；校正性别、年龄和BMI时，分析rs174545、rs2072114、rs174602和rs174616四个SNP位点与2型糖尿病患者血清PUFAs、去饱和酶活性以及2型糖尿病发病风险的相关性。结果：1按照基因型分析血清PUFAs的含量及去饱和酶活性1.1rs174545位点突变对血清PUFAs及去饱和酶活性的影响在健康人中，rs174545（C>G）位点携带G基因型的个体血清LA的相对含量增加，AA的含量相对降低；在2型糖尿病患者中，rs17454（5C>G）位点携带G基因型的个体不仅血清LA相对含量增加，AA相对含量降低，还出现了EPA与DPA相对含量的下降（P<0.05）。另外，rs174545（C>G）位点携带G基因型还可以使健康人和2型糖尿病患者血清中AA/LA和EPA/ALA的比值下降（P<0.05）。1.2rs2072114位点突变对血清PUFAs及去饱和酶活性的影响在健康人中，rs2072114（A>G）位点携带G基因型的个体血清AA的含量相对降低；在2型糖尿病患者中，rs2072114（A>G）位点携带G基因型的个体不仅血清LA相对含量增加，AA相对含量降低，还出现了EPA与DPA相对含量的下降（P<0.05）。另外，rs2072114（A>G）位点携带G基因型还可以使健康人和2型糖尿病患者血清中AA/LA和EPA/ALA的比值下降（P<0.05）。1.3rs174602位点突变对血清PUFAs及去饱和酶活性的影响在健康人中，rs174602（A>G）位点携带G基因型的个体血清LA的含量相对增加，AA和EPA的含量相对降低；在2型糖尿病患者中，rs174602（A>G）位点携带G基因型的个体不仅血清LA相对含量增加，AA相对含量降低，还出现了DPA相对含量的下降（P<0.05）。另外，rs174602（A>G）位点携带G基因型还可以使健康人血清中AA/LA和EPA/ALA，及2型糖尿病患者组血清中EPA/ALA比值下降（P<0.05）。1.4rs174616位点突变对血清PUFAs及去饱和酶活性的影响在健康人中，rs174616（C>T）位点携带T基因型的个体血清AA含量相对降低，对其他PUFAs没有影响；在2型糖尿病患者中，rs174616（C>T）位点携带T基因型的个体血清LA相对含量增加（P<0.05），对其他PUFAs也没有影响。另外，rs174616（C>T）位点携带T基因型还可以使健康人和2型糖尿病患者血清中AA/LA的比值下降（P<0.05）。以上结果说明：rs174545、rs2072114、rs174602和rs174616均可以影响健康人和2型糖尿病患者体内的PUFAs含量与AA/LA和（或）EPA/ALA的比值，其中rs174616只对n-6系PUFAs的代谢有影响。另外，同一种突变因素在健康人和2型糖尿病体内引起的表现不同。2FADS1-FADS2基因簇的SNP突变与2型糖尿病发病风险的相关性研究2.1Logistic回归分析（未剔除混杂因素）结果显示：rs174616C>T与2型糖尿病的发病风险存在着负相关。在共显性模型下，与携带rs174616CC基因型的个体比较，携带rs174616CT和rs174616TT基因型的个体发生2型糖尿病的风险降低，OR值分别为0.708（95%CI=0.508,0.987, P=0.041）和0.720（95%CI=0.521,0.985，P=0.043）；在显性模型下，与携带rs174616CC基因型的个体比较，携带rs174616（CT+TT）基因型的个体发生2型糖尿病的风险降低，OR值为0.717（95%CI=0.518,0.992，P=0.042）；而在隐性模型下，与携带rs174616（CC+CT）基因型的个体比较，携带rs174616TT基因型的个体发生2型糖尿病的风险没有变化。rs174545，rs2072114和rs174602，与2型糖尿病的发病风险无关。以健康者为对照组，以2型糖尿病为病例组，在3种模型下差异均无统计学意义。2.2调整性别与年龄（调整1）结果显示：在调整性别与年龄之后，rs174616C>T与2型糖尿病的发生率仍成负相关。在共显性模型下，携带rs174616CT和rs174616TT基因型的个体比携带rs174616CC基因型的个体，发生2型糖尿病的风险降低，OR值为0.628（95%CI=0.437,0.901，P=0.011）和0.619（95%CI=0.441,0.889，P=0.010）；在显性模型下，携带rs174616（CT+TT）基因型的个体比携带rs174616CC基因型的个体发生2型糖尿病的风险降低，OR值为0.630（95%CI=0.442,0.897，P=0.01）；在隐性模型下，rs174616的基因型与2型糖尿病发病仍然无关。调整性别与年龄后，其他3个位点：rs174545，rs2072114和rs174602仍与2型糖尿病的发病风险无关。2.3调整性别、年龄和BMI（调整2）结果显示：在调整性别、年龄与BMI之后，rs174616C>T与2型糖尿病的发生率仍成负相关。在共显性模型下，携带rs174616CT和rs174616TT基因型的个体比携带rs174616CC基因型的个体，发生2型糖尿病的风险降低，OR值为0.656（95%CI=0.447,0.964，P=0.032）和0.652（95%CI=0.440,0.931，P=0.020）；在显性模型下，携带rs174616（CT+TT）基因型的个体比携带rs174616CC基因型的个体发生2型糖尿病的风险降低，OR值为0.646（95%CI=0.443,0.943，P=0.023）；在隐性模型下，rs174616的基因型与2型糖尿病发病仍然无关。调整性别、年龄和BMI后，其他3个位点： rs174545，rs2072114和rs174602仍与2型糖尿病的发病风险无关。以上结果说明，在排除了性别、年龄和BMI的干扰后，携带突变型基因rs174616（CT+TT）的个体比携带野生型基因rs174616CC的个体，发生2型糖尿病的风险下降，即该位点的突变是2型糖尿病发病的保护因素。而rs174545，rs2072114和rs174602三个位点的突变则与2型糖尿病的发病风险无关。3按照显性模型分析rs174616位点SNP突变对血清PUFAs及去饱和酶活性的影响为了进一步探讨rs174616与2型糖尿病患者血清PUFAs代谢的关系，接下来我们按照rs174616CC和rs174616（CT+TT）基因型分别对健康非糖尿病患者和2型糖尿病患者血清PUFAs含量，以及AA/LA和EPA/ALA的比值进行了分析。结果显示：在健康人，携带rs174616（CT+TT）基因型的个体比携带rs174616CC基因型的个体AA/LA的比值下降；在2型糖尿病患者中。携带rs174616（CT+TT）基因型的个体比携带rs174616CC基因型的个体LA含量增加，AA/LA比值下降。另外，rs174616位点突变对n-3系PUFAs及EPA/ALA均没有影响。小结：1在中国北方汉族人群中，FADS1-FADS2基因簇中rs174545、rs2072114、rs174602和rs174616四个突变位点都能降低健康人和2型糖尿病患者△5D和△6D的活性，从而影响血清中LA、AA和EPA的含量，而对ALA和DHA的含量没有影响。2在中国北方汉族人群中，FADS1-FADS2基因簇中rs174616位点突变与2型糖尿病的发生呈负相关，即携带rs174616（CT+TT）基因型的个体2型糖尿病的发病风险明显下降，可能与rs174616（CT+TT）基因型能够降低体内AA的合成有关。第三部分过氧化物酶体β-氧化活性增强与2型糖尿病大鼠肝脏DHA合成增加有关目的：从肝脏合成脂肪酸角度探讨2型糖尿病时DHA变化的机制方法：用高脂饮食加小剂量链脲左菌素（streptozotocin, STZ）的方法诱导2型糖尿病大鼠模型，检测2型糖尿病大鼠肝脏脂肪酸谱；△5去饱和酶（△5-desaturase,△5D）和△6去饱和酶（△6D）表达水平；过氧化物酶体β氧化活性和相关酶的表达及DHA合成活性等方面去研究肝脏DHA合成情况，为寻找2型糖尿病时体内DHA改变的原因提供实验依据。结果：12型糖尿病大鼠肝脏脂肪酸谱由于食用的是高脂饮食，与Con组大鼠相比，2型糖尿病大鼠肝脏中C18:0和C18:1n-9（高脂饮食中主要的脂肪酸）明显增加；SFAs/PUFAs的比值增高，而长链饱和脂肪酸C24:0则明显降低。另外，与Con组大鼠相比，2型糖尿病大鼠肝脏中绝大多数的PUFAs（ALA、LA、AA、EPA和DPA）和总PUFAs都明显下降，但是我们却意外的发现DHA和C22:4n-6明显增加，几乎是Con组的2倍；而且2型糖尿病大鼠肝脏DHA/ALA的比值也增加了，大约是Con组的5倍。因此，以上结果提示，2型糖尿病大鼠肝脏DHA的含量增加，增加的DHA可能是由于在合成增加引起的。22型糖尿病大鼠肝脏DHA合成过程中关键酶的表达为了进一步研究2型糖尿病大鼠肝脏DHA增多与DHA合成代谢的关系，我们检测了DHA合成过程中关键酶的表达，结果显示：与Con组相比，2型糖尿病大鼠肝脏△5D和△6D的mRNA和蛋白质表达水平均下降，而过氧化物酶体β氧化过程中的酶直链脂酰CoA氧化酶（straight-chainacyl-CoA oxidase, SCOX）、D双功能蛋白（D-bifunctional protein, DBP）和3-酮脂酰CoA硫解酶（3-Ketoacyl-CoAthiolase, THL）的表达增加。由此推断，2型糖尿病大鼠肝脏DHA增多是由于过氧化物酶体阶段β氧化增强引起的，而与内质网阶段的去饱和、延长反应无关。32型糖尿病大鼠肝脏过氧化物酶体β氧化阶段DHA合成活性为了证实过氧化物酶体β氧化阶段与2型糖尿病时肝脏DHA合成增多有关，首先，我们对2型糖尿病大鼠肝脏过氧化物酶体β氧化活性进行了测定。结果显示过氧化物酶体β氧化活性增加。这一结果与此过程中的酶表达增加相符，也与前面的结果中提到2型糖尿病大鼠肝脏C24:0含量下降一致，因为极长链脂肪酸C24:0在体内只能够通过过氧化物酶体被氧化代谢。接下来，我们用C24:6n-3作为底物，与肝组织匀浆共孵育，直接检测过氧化物酶体β氧化阶段DHA的合成。结果显示：C24:6n-3与肝组织匀浆共孵育4小时后，2型糖尿病大鼠肝脏增加的DHA和减少的C24:6n-3均比对照组变化明显。由此可见，2型糖尿病大鼠肝脏过氧化物酶体β氧化活性增加与DHA合成增强有关。小结：1高脂饮食加小剂量STZ诱导的2型糖尿病大鼠肝脏绝大多数PUFAs明显减少，而只有DHA含量增加。22型糖尿病大鼠肝脏DHA增加，增多的DHA与过氧化物酶体β氧化活性增强有关，而与内质网△5和△6去饱和酶的表达下降无关。结论：12型糖尿病患者不仅存在血清总游离脂肪酸的增多，而且血清脂肪酸谱也发生了明显变化，n-3系PUFAs中DHA的含量明显下降；n-6系PUFAs中AA的含量明显增加，LA的含量则明显降低。2在中国北方汉族人群中，FADS1-FADS2基因簇的rs174616（C>T）位点SNP突变与2型糖尿病的发病风险呈负相关，是2型糖尿病发生的保护因素。这种保护作用可能与rs174616突变能够抑制体内AA合成有关。3肝脏过氧化物酶体β氧化活性增强与2型糖尿病大鼠肝脏DHA合成增加有关。