非酒精性脂肪肝(nonalcoholic fatty liver disease,NAFLD)是一种常见的代谢性疾病,以无过量饮酒史、肝细胞脂肪变性和脂质沉积为主要病理特征。非酒精脂肪肝不是一种独立性疾病,其病因与肥胖、高脂血症、糖尿病等代谢性疾病密切相关。关于NAFLD的发病机制,目前广泛认为的是“二次打击”学说。第一次打击认为胰岛素抵抗是引起脂肪肝的关键致病因子。第二次打击涉及脂肪组织分泌的游离脂肪酸、脂肪因子、细胞因子以及应激反应等多重因素的共同参与。可以说,NAFLD与肥胖在发病过程中存在许多关联的病理生理基础。肥胖是多种疾病的“共同土壤”,是脂肪组织功能异常的重要体现。脂肪组织是体内最大的内分泌和旁分泌器官,其分泌物游离脂肪酸(Free fatty acid,FFA)作为一种信号分子,可通过激活炎症、应激等多种通路扰乱体内糖脂代谢紊乱,继而引起体内其它代谢器官如肝脏、心肌、骨骼肌等发生病变。FABP4(Adipocyte fatty acid binding proteins,又叫aP2)是脂肪酸结合蛋白家族的一员,作为FFA的分子伴侣蛋白,通过与脂肪酸结合,促进FFA的转运,参与代谢和信号转导过程。已经有报道证实肥胖、脂肪肝、糖尿病患者循环血液中FFA、FABP4的含量明显高于正常人。FABP4在脂肪组织中大量表达,但在肝组织的表达和意义尚未见报道。越来越多的研究证实,内质网应激(endoplasmic reticulum stress,ERs)可能是连接肥胖(FABP4)与非酒精性脂肪肝的一个核心机制。内质网(endoplasmic reticulum,ER)是参与细胞蛋白质、脂质合成的一个重要细胞器,并且参与钙离子的储存及其信号传导。当机体内营养过剩、脂肪酸增高、钙平衡紊乱、葡萄糖剥夺以及病原微生物刺激时,内质网的稳态就会被打乱,导致内质网应激。ERs主要包括三条信号通路:1)未折叠蛋白反应(UPR);2)内质网超负荷反应(EOR);3)固醇调节级联反应。目前认为UPR是内质网应激的主要效应通路,由三个跨膜蛋白所介导,分别是:内质网RNA样蛋白激酶(PERK)、肌醇依赖酶1(IRE1)、激活的转录因子6(ATF6)。固醇调节级联反应则以SREBP1c为主,其为肝脏脂肪酸合成的主要调节因子,当其表达增高时可导致脂肪肝形成。黄芪散是治疗消渴病的古方,全方由黄芪、葛根、桑白皮组成。我们前期的动物试验证明:黄芪散实验组可显著降低糖尿病大鼠体重及血中FFA水平,可改善胰岛素抵抗和脂肪肝,但是其减肥保肝的确切机制尚不清楚。综上所述,本课题主要研究如下:目的:因此,本课题拟通过建立高脂喂养诱导的肥胖大鼠NAFLD模型和细胞模型,在动物整体水平和细胞水平上,采用酶联免疫Elisa、荧光实时定量RT-PCR(Real Time PCR)、蛋白印迹WB等方法,研究黄芪散对肥胖和脂肪肝的预防治疗作用,探讨其对FABP4和内质网应激的影响;利用转录组测序(RNA-Seq)方法,证实FABP4和内质网应激在NAFLD发病中的参与作用;并利用FABP4过表达手段,初步揭示FABP4影响内质网应激的分子机制,以此探讨黄芪散调控FABP4表达改善肥胖和非酒精性脂肪肝的作用机制。此外,由于中药复方的作用多靶点,机制复杂,尚需不断扩展黄芪散对糖脂代谢性疾病的药理机制,为临床应用提供更多的实验依据。方法:1.黄芪散对高脂饮食诱导肥胖大鼠NAFLD的预防和治疗作用研究本实验包括黄芪散(HQS)预防给药和治疗给药两部分。将72只健康雄性SD大鼠随机分为正常组(SD,n=12)和造模组(n=60),正常组采用基础饲料喂养,造模组采用高脂饲料喂养,同时选取12只造模组大鼠为模型组(HFD)。黄芪散预防给药:将造模组大鼠随机分为HQS-L低剂量组(1.2 g/kg.d)、HQS-H高剂量组(2.4 g/kg.d),每组8只,同时造模同时给药,连续给药15周。黄芪散治疗给药:将造模组大鼠连续高脂喂养7周后诱导肥胖大鼠模型,筛选24只随机分为HQS-L低剂量组(1.2 g/kg.d)、HQS-H 高剂量组(2.4 g/kg.d)、立普妥阳性药组(Lipitor,2 mg/kg),每组 8只,高脂喂养7周后再开始给药,连续给药15周。考察黄芪散对大鼠体重、糖脂代谢、胰岛素、糖耐量、肝脏脂质(TC、TG)、同型半胱氨酸(Hcy)、谷氨酰转肽酶(GGT1)水平以及附睾脂肪、肝组织的病理形态学及脂肪变性(HE染色和油红O染色)的影响;同时利用micro-CT观察黄芪散对大鼠脂肪率、皮下脂肪、内脏脂肪及肝脂肪率的影响,从而评价黄芪散对肥胖大鼠NAFLD的预防和治疗作用。2.黄芪散对高脂饮食诱导肥胖大鼠FABP4及肝脏内质网应激的影响进一步考察黄芪散对高脂饮食诱导肥胖大鼠NAFLD的作用机制。首先采用免疫组化法检测FABP4在大鼠附睾脂肪和肝组织中的分布和定位;然后采用Elisa和ACS-ACOD法测定血浆FABP4、FFA水平;采用RT-PCR法测定附睾脂肪中FABP4、FAS的mRNA水平,以及肝脏中脂质基因FABP4、FAS、ApoB100、PPARy和内质网基因SREBP-1c、ATF6、PERK、JNK的mRNA水平;采用WB法测定附睾脂肪和肝组织中FABP4的蛋白水平,以及肝组织中FAS、SphK2、p-AKT、SREBP-1c、PERK、IRE-1α/p-IRE-1α的蛋白表达水平,从而探讨黄芪散通过调控FABP4和内质网应激改善肥胖和脂肪肝的作用机制。3.黄芪散对高脂饮食诱导肥胖大鼠的转录组学(RNA-Seq)研究分别取正常组、模型组、立普妥组、黄芪散预防给药高剂量组和治疗给药高剂量组大鼠的肝、附睾脂肪组织各3例,提取总RNA,质检和定量后用oligo(dT)磁珠富集mRNA,构建RNA测序文库,文库质检后由RT-PCR法进行文库定量。使用Illumina Hiseq 4000测序仪进行测序,对测序结果进行标准化,筛选出差异表达基因,并对差异表达基因进行GO功能和Pathway富集分析。通过观察给药前后肝脏、附睾脂肪组织中差异基因的表达情况以及结合功能分析,进而考察FABP4和内质网应激在黄芪散防治疾病中的参与作用。4.FABP4对内质网应激的影响及黄芪散的干预研究①培养3T3-L1前脂肪细胞,利用经典“鸡尾酒”诱导法建立成熟3T3-L1脂肪细胞,观察细胞上清液中FABP4的含量变化;利用黄芪散进行干预,观察黄芪散对3T3-L1细胞的增殖以及对FABP4、PPARy脂代谢相关基因的影响,以期评价黄芪散通过调控FABP4表达改善肥胖的作用。②采用不同浓度棕榈酸(PA)诱导L02肝细胞脂肪变性模型,根据MTT检测细胞存活率,采用油红O染色检测脂肪细胞变性,筛选PA的最佳作用浓度。在L02脂变模型下,加入FABP4重组蛋白过表达,并用黄芪散进行干预,分为7组,分别为空白对照组、PA组、FABP4组、PA+FABP4组、PA+HQS组、FABP4+HQS 组、PA+FABP4+HQS 组。利用 RT-PCR法检测FABP4、PERK、ATF6、IRE-1α的mRNA表达水平,初步评价FABP4对内质网应激的调控在黄芪散改善非酒精性脂肪肝中的作用。结果:1.与正常组相比,模型组大鼠体重显著升高,肝组织病理显著病变且脂肪变性明显,成功复制了肥胖大鼠NAFLD模型。从黄芪散预防给药和治疗给药两方面结果来看,黄芪散可显著降低大鼠体重、FPG、TC、TG、LDL-C水平,改善糖耐量,降低FINS水平;黄芪散可显著降低肝脏TC、TG、Hcy、GGT1水平,对肝组织的病变及脂肪变性具有保护作用;同时黄芪散可显著降低大鼠脂肪率、皮下脂肪、内脏脂肪及肝脂肪率。以上结果提示黄芪散具有较好的改善肥胖和脂肪肝作用,且预防给药优于治疗给药,黄芪散作用效果优于立普妥。2.免疫组化结果显示FABP4在脂肪细胞毛细血管和小静脉的内皮细胞以及肝静脉内皮细胞的胞浆和胞核里有表达。黄芪散可显著降低血浆中FABP4和FFA水平。RT-PCR和WB检测结果显示,黄芪散可明显下调大鼠附睾脂肪和肝组织中FABP4的mRNA和蛋白水平,也可明显下调肝组织中FAS、PPARγ、ATF6、SREBP-1c、PERK、IRE-1α/p-IRE-1α的mRNA或蛋白水平,对SphK2、p-AKT水平有所提升,预防给药和治疗给药之间存在一定区别。以上结果提示黄芪散可以调控FABP4和内质网应激。3.比较分析各组大鼠基因测序结果发现,FABP4作为其中一个显著差异基因,在模型组中高表达,在黄芪散预防组和黄芪散治疗组中低表达,而在立普妥组无显著性表达。经过功能分析,黄芪散可以影响多条与应激反应相关的GO条目。同时又筛选出其他差异表达基因,均在黄芪散组得到显著下调。4.①在3T3-L1脂肪细胞成脂分化过程中,上清液中FABP4的分泌量显著增加,且在第10天诱导分化成熟之后含量最高。黄芪散可以明显改善成熟脂肪细胞中FABP4、PPARγ的mRNA水平。②对PA的浓度考察发现,0.5 mM的浓度能显著提高L02细胞的脂肪变性。与空白组相比,经FABP4过表达后,PA组、FABP4组和PA+FABP4 组的 FABP4 和 PERK、ATF6、IRE-1α 水平显著上升,且 PA+FABP4 组的上升幅度最大;与PA+FABP4组相比,PA+HQS组、FABP4+HQS组和PA+FABP4+HQS组均能显著降低FABP4和PERK、ATF6、IRE-1α水平,且在FABP4过表达下,PA+FABP4+HQS组对内质网应激的改善作用低于PA+HQS组和FABP4+HQS组。以上结果提示黄芪散可通过抑制FABP4的表达,缓解肝细胞内质网应激。结论:1.无论是预防给药还是治疗给药,黄芪散均可以明显降低肥胖大鼠体重、改善糖脂代谢紊乱,降低皮下、内脏脂肪堆积和肝脏指数,明显改善肝组织病理形态和脂肪变性,改善肝脏脂质沉积,提示黄芪散具有减肥保肝作用。2.FABP4在附睾脂肪和肝脏中均有表达。黄芪散显著降低肥胖大鼠血浆中FABP4、FFA水平,显著下调附睾脂肪和肝组织中FABP4的mRNA和蛋白水平,可显著减缓肝脏内质网应激损伤,提示黄芪散通过调控FABP4和内质网应激改善肥胖和脂肪肝。3.在细胞水平上,黄芪散可显著降低3T3-L1成熟脂肪细胞分泌液中FABP4含量,显著降低脂肪细胞中FABP4和PPARy mRNA表达,提示黄芪散可能具有较好的减肥作用。黄芪散可显著改善棕榈酸诱导的L02肝细胞内质网应激,在FABP4过表达下,对内质网应激的改善作用减弱,提示黄芪散可能通过抑制FABP4表达缓解肝细胞内质网应激,从而改善肝细胞脂肪变性。4.转录组测序(RNA-Seq)结果同样证实FABP4在黄芪散作用下可显著下调,同时黄芪散的其他靶向基因也需要继续扩展。