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乙型脑炎病毒（Japanese encephalitis virus，JEV)和寨卡病毒（Zika virus，ZIKV）均属于黄病毒科黄病毒属单正链RNA病毒[1]。JEV是引起流行性乙型脑炎的病原体，其感染常伴有一系列中枢神经系统症状[2]。除了发热和皮疹，ZIKV感染还可引起格林-巴利综合征和小头症[3]。这两种病毒存在以下相似性：二者流行的国家存在重叠性；二者病毒基因组序列、编码的蛋白氨基酸序列、E蛋白序列存在约50%同源性等。研究表明黄病毒属成员之间存在广泛的抗体交叉反应。但是，JEV免疫力（尤其是JEV-E蛋白诱导的抗体反应）对ZIKV感染有何种作用尚不得而知。鉴于JEV疫苗已在10多个国家列入计划免疫接种，因此，研究JEV-E蛋白免疫诱导的抗体对ZIKV感染有何作用对于ZIKV疫苗研发以及ZIKV感染的紧急防治具有重要的科学意义和应用价值。
目的：
1.原核表达JEV-E和ZIKV-E蛋白；
2.评估JEV-E蛋白免疫小鼠诱导的抗体体外识别ZIKV的能力，及对ZIKV感染的作用；
3.探讨JEV-E蛋白免疫小鼠诱导的抗体体内对ZIKV感染的作用。
方法：
1.JEV-E和ZIKV-E蛋白的原核表达和纯化：
委托生物公司合成编码JEV-E、ZIKV-E蛋白的全基因序列并克隆入原核表达质粒pET21a，进而转化进入大肠杆菌BL21菌株。诱导含有重组质粒的BL21细菌表达E蛋白，采用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）和Western Blot（WB）实验方法检测上述两种蛋白的表达情况；超声破碎细菌，采用Ni-NTA亲和层析柱分离纯化JEV-E和ZIKV-E重组蛋白。
2.JEV-E蛋白免疫小鼠：
将6周龄雌性C57BL/6小鼠分成2组，一组为Mock免疫组，另一组为JEV-E蛋白免疫组。采用JEV-E蛋白免疫小鼠两次，两次间隔2周（首次JEV-E蛋白与等量弗氏完全佐剂乳化，末次JEV-E蛋白与等量弗氏不完全佐剂乳化，50μg蛋白/只小鼠/次）。末次免疫2周后，处死小鼠并心脏采血分离血清。
3.JEV-E蛋白免疫诱导产生的抗体体外交叉识别ZIKV-E蛋白的研究：
基于JEV-E、ZIKV-E蛋白包被的酶标板，采用间接酶联免疫吸附实验（ELISA）和间接免疫荧光实验（IFA）检测JEV-E蛋白免疫小鼠诱导的抗体（免疫血清）识别JEV-E、ZIKV-E蛋白的能力，及识别ZIKV的能力。
4.JEV-E蛋白免疫诱导产生的抗体体外增强ZIKV感染的作用：
基于佛波酯（PMA）处理的U937细胞，采用体外抗体依赖增强感染效应（ADE）实验研究JEV-E蛋白免疫小鼠诱导的抗体（免疫血清）是否具有增强ZIKV感染的作用。
5.JEV-E蛋白免疫诱导产生的抗体体外对ZIKV感染的中和作用研究：
基于Vero细胞，采用体外微中和实验评估JEV-E蛋白免疫小鼠诱导的抗体（免疫血清）体外中和ZIKV感染的作用。
6.JEV-E蛋白免疫诱导产生的抗体保护乳鼠抵抗致死量ZIKV攻击的研究：
将不同剂量的JEV-E蛋白免疫小鼠诱导产生的抗体（免疫血清）（终剂量为0.0001μl、3μl、15μl、75μl）分别注入一日龄C57BL/6小鼠背部皮下。2h后，将1?102FFU（病毒空斑形成单位）的ZIKV注入小鼠背部皮下，逐日（共28日）记录小鼠体重变化和死亡情况。
结果：
1.采用大肠杆菌表达了高纯度的JEV-E蛋白和ZIKV-E蛋白；
2.JEV-E蛋白免疫小鼠后展示了较好的免疫原性，ELISA结果显示其诱导了高水平的抗JEV-E蛋白抗体反应并且能够交叉识别ZIKV-E蛋白；IFA结果显示JEV-E蛋白免疫血清能交叉识别ZIKV感染细胞；
3.体外ADE实验结果显示JEV-E蛋白免疫小鼠诱导产生的抗体可增强ZIKV感染U937细胞，且其增强感染的倍数与JEV-E蛋白免疫血清浓度呈正比，当血清稀释度为1∶4时，增强感染的倍数为15倍；
4.微中和实验结果显示JEV-E蛋白免疫小鼠诱导产生的抗体可中和ZIKV感染Vero细胞，对ZIKV的抑制率与JEV-E蛋白免疫血清浓度呈正比，当血清稀释度为1∶4时，抑制率为67%。免疫血清的NT50（达到50%中和时的血清最高稀释度）为1∶158；
5.小鼠生存实验结果显示：高浓度的JEV-E蛋白免疫诱导产生的抗体（终剂量为3μl、15μl、75μlJEV-E蛋白免疫小鼠血清）可以保护一日龄乳鼠抵抗致死剂量ZIKV的攻击，具体表现为可显著提高小鼠的生存率、降低小鼠体重减轻情况。但是，极低剂量JEV-E蛋白免疫小鼠血清（0.0001μl）对ZIKV感染的小鼠不再具有保护作用，反而轻度增加了小鼠体重减轻情况；
6.JEV-E蛋白免疫的雌鼠所娩出的一日龄乳鼠血清中存在JEV-E蛋白和ZIKV-E蛋白反应性IgG。
结论：
JEV-E蛋白免疫小鼠诱导的抗体可交叉识别ZIKV-E蛋白，其体外对ZIKV既有中和作用也有潜在增强感染作用；高浓度JEV-E蛋白特异性抗体可保护小鼠抵抗致死性ZIKV感染而低浓度则有加重ZIKV感染的小鼠的病情的趋势。
目的：
1.原核表达JEV-E和ZIKV-E蛋白；
2.评估JEV-E蛋白免疫小鼠诱导的抗体体外识别ZIKV的能力，及对ZIKV感染的作用；
3.探讨JEV-E蛋白免疫小鼠诱导的抗体体内对ZIKV感染的作用。
方法：
1.JEV-E和ZIKV-E蛋白的原核表达和纯化：
委托生物公司合成编码JEV-E、ZIKV-E蛋白的全基因序列并克隆入原核表达质粒pET21a，进而转化进入大肠杆菌BL21菌株。诱导含有重组质粒的BL21细菌表达E蛋白，采用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）和Western Blot（WB）实验方法检测上述两种蛋白的表达情况；超声破碎细菌，采用Ni-NTA亲和层析柱分离纯化JEV-E和ZIKV-E重组蛋白。
2.JEV-E蛋白免疫小鼠：
将6周龄雌性C57BL/6小鼠分成2组，一组为Mock免疫组，另一组为JEV-E蛋白免疫组。采用JEV-E蛋白免疫小鼠两次，两次间隔2周（首次JEV-E蛋白与等量弗氏完全佐剂乳化，末次JEV-E蛋白与等量弗氏不完全佐剂乳化，50μg蛋白/只小鼠/次）。末次免疫2周后，处死小鼠并心脏采血分离血清。
3.JEV-E蛋白免疫诱导产生的抗体体外交叉识别ZIKV-E蛋白的研究：
基于JEV-E、ZIKV-E蛋白包被的酶标板，采用间接酶联免疫吸附实验（ELISA）和间接免疫荧光实验（IFA）检测JEV-E蛋白免疫小鼠诱导的抗体（免疫血清）识别JEV-E、ZIKV-E蛋白的能力，及识别ZIKV的能力。
4.JEV-E蛋白免疫诱导产生的抗体体外增强ZIKV感染的作用：
基于佛波酯（PMA）处理的U937细胞，采用体外抗体依赖增强感染效应（ADE）实验研究JEV-E蛋白免疫小鼠诱导的抗体（免疫血清）是否具有增强ZIKV感染的作用。
5.JEV-E蛋白免疫诱导产生的抗体体外对ZIKV感染的中和作用研究：
基于Vero细胞，采用体外微中和实验评估JEV-E蛋白免疫小鼠诱导的抗体（免疫血清）体外中和ZIKV感染的作用。
6.JEV-E蛋白免疫诱导产生的抗体保护乳鼠抵抗致死量ZIKV攻击的研究：
将不同剂量的JEV-E蛋白免疫小鼠诱导产生的抗体（免疫血清）（终剂量为0.0001μl、3μl、15μl、75μl）分别注入一日龄C57BL/6小鼠背部皮下。2h后，将1?102FFU（病毒空斑形成单位）的ZIKV注入小鼠背部皮下，逐日（共28日）记录小鼠体重变化和死亡情况。
结果：
1.采用大肠杆菌表达了高纯度的JEV-E蛋白和ZIKV-E蛋白；
2.JEV-E蛋白免疫小鼠后展示了较好的免疫原性，ELISA结果显示其诱导了高水平的抗JEV-E蛋白抗体反应并且能够交叉识别ZIKV-E蛋白；IFA结果显示JEV-E蛋白免疫血清能交叉识别ZIKV感染细胞；
3.体外ADE实验结果显示JEV-E蛋白免疫小鼠诱导产生的抗体可增强ZIKV感染U937细胞，且其增强感染的倍数与JEV-E蛋白免疫血清浓度呈正比，当血清稀释度为1∶4时，增强感染的倍数为15倍；
4.微中和实验结果显示JEV-E蛋白免疫小鼠诱导产生的抗体可中和ZIKV感染Vero细胞，对ZIKV的抑制率与JEV-E蛋白免疫血清浓度呈正比，当血清稀释度为1∶4时，抑制率为67%。免疫血清的NT50（达到50%中和时的血清最高稀释度）为1∶158；
5.小鼠生存实验结果显示：高浓度的JEV-E蛋白免疫诱导产生的抗体（终剂量为3μl、15μl、75μlJEV-E蛋白免疫小鼠血清）可以保护一日龄乳鼠抵抗致死剂量ZIKV的攻击，具体表现为可显著提高小鼠的生存率、降低小鼠体重减轻情况。但是，极低剂量JEV-E蛋白免疫小鼠血清（0.0001μl）对ZIKV感染的小鼠不再具有保护作用，反而轻度增加了小鼠体重减轻情况；
6.JEV-E蛋白免疫的雌鼠所娩出的一日龄乳鼠血清中存在JEV-E蛋白和ZIKV-E蛋白反应性IgG。
结论：
JEV-E蛋白免疫小鼠诱导的抗体可交叉识别ZIKV-E蛋白，其体外对ZIKV既有中和作用也有潜在增强感染作用；高浓度JEV-E蛋白特异性抗体可保护小鼠抵抗致死性ZIKV感染而低浓度则有加重ZIKV感染的小鼠的病情的趋势。