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褐藻胶作为海洋三大多糖之一,来源广阔,在海洋生物资源中占据重大比例。褐藻胶裂解酶能够降解褐藻胶产生具有不同生物学功能的褐藻寡糖,因而在各个领域中有着广泛的应用。目前试剂级的褐藻胶裂解酶价格昂贵,限制了其在工业上的应用。本文通过对前期从海洋细菌Pseudoalteromonas sp.Alg6B中得到的褐藻胶裂解酶基因alg6b-6、alg6b-7、alg6b-17进行最优基因的筛选,然后以最优基因alg6b-7为对象,基于同源建模、同源性比对、分子对接的半理性设计,选择一些特殊位点进行定点突变,筛选得到了4株正向突变株。随后以4个单点为基础,筛选构建了3株组合突变体,并对这些突变体的酶学性质和酶解产物进行了表征。研究的主要内容和结果如下:（1）重组菌株诱导产酶条件的优化。对重组菌株Escherichia coli BL21（DE3）/p ET-28a-alg6b-6、E.coli BL21（DE3）/p ET-28a-alg6b-7和E.coli BL21（DE3）/p ET-28a-alg6b-17的诱导条件进行优化,包括IPTG的浓度、IPTG的添加时机、诱导时间和诱导温度。实验结果表明,E.coli BL21（DE3）/p ET-28a-alg6b-6和E.coli BL21（DE3）/p ET28a-alg6b-17经优化后酶活并无明显变化;E.coli BL21（DE3）/p ET-28a-alg6b-7在OD600为0.8时添加0.4 mmol·L-1的IPTG诱导8 h后酶活达135 U·m L-1。综合优化结果,后续将以E.coli BL21（DE3）/p ET-28a-alg6b-7为研究对象。（2）正向突变体的筛选及酶学性质分析。基于对Alg6B-7的同源建模、同源序列比对、分子对接构建了突变体库,筛选到4个正向突变体I62A、A99K、V132S和L157T,纯化后的比活分别为732.53 U·mg-1、753.61 U·mg-1、927.52 U·mg-1、801.04 U·mg-1,分别比突变前提高了38.84%、42.85%、75.8%、51.83%。I62A和A99K的最适反应条件为:35℃,p H 9.5;V132S和L157T的最适反应条件为:30℃,p H 8.0。所有突变体在30℃～40℃下孵育2 h仍具有60%以上的活力,且在碱性条件下具有较强的稳定性。Ca2+、K+、Mg2+、Mn2+、Li+、Na+对其有促进作用,SDS、EDTA、DTT等具有抑制作用。（3）组合突变体的筛选及酶学性质分析。将上述筛选的4个单位点进行双点、三点、四点的组合突变,筛选得到了3个组合突变体I62A/L157T、I62A/V132S/L157T和I62A/A99K/V132S/L157T,比活分别为969.68 U·mg-1、1042.94 U·mg-1、1124.1 U·mg-1,比突变前分别提高了83.8%、97.72%、113.28%。其中,I62A/L157T的最适反应条件为:30℃,p H 8.0;I62A/V132S/L157T和I62A/A99K/V132S/L157T的最适反应条件为:35℃,p H 8.0/p H 9.5。组合突变体的热稳定性较单点突变明显提升,Ca2+、K+、Na+等的促进作用也更明显,其中0.3～0.4 mol·L-1的Na+和0.1～0.3 mol·L-1的K+的促进效果最佳。（4）褐藻胶酶解优化和产物分析。通过控制底物浓度、酶的添加量、酶解时间来优化褐藻胶的酶解反应。实验结果表明:当按55 U·m L-1的添加量将褐藻胶裂解酶加到10mg·m L-1的底物溶液中酶解6 h时,褐藻胶的酶解效果最佳。在最佳水解条件下控制酶解时间,采用薄层层析法（TLC）对酶解产物进行初步定性分析,产物构成为二糖、三糖和四糖,三糖为主要产物,表明Alg6B-7通过内切的方式对褐藻胶进行裂解。