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目的研究维甲酸/干扰素诱导细胞死亡相关基因19(Gene associated with retinoid interferon induced mortality 19,GRIM19)对多囊卵巢综合征(Polycystic ovary syndrome,PCOS)患者颗粒细胞的血管内皮生长因子(Vascular endothelial growth factor,VEGF)的调节作用,并探讨其潜在的分子调控机制。方法选取PCOS患者及正常人的卵巢原代颗粒细胞(Primary granulosa cells,PGC)作为研究对象,研究GRIM19对PCOS患者PGC的VEGF的调控作用。同时,利用siRNA沉默技术以及质粒过表达技术来下调或上调PCOS患者PGC细胞中GRIM19基因的表达,并检测处理前后VEGF的mRNA及蛋白相对表达量的差异。同样,分别用不同浓度梯度的睾酮(Testosterone)孵育正常人的PGC,模拟PCOS患者体内的高雄激素环境。并检测PGC细胞中的GRIM19、VEGF及STAT3的mRNA和蛋白的相对表达量,以探究PCOS中GRIM19对VEGF可能的调节机制。最后为了进一步验证GRIM19对VEGF的调节作用,选择人卵巢颗粒细胞系(KGN细胞)作为实验模型,利用siRNA干扰技术下调GRIM19基因后,检测VEGF及STAT3的mRNA和蛋白的表达量。同时,还通过GRIM19过表达质粒转染KGN细胞,并检测VEGF、STAT3表达量的变化。结果一、PGC中GRIM19对VEGF表达的调控未经任何处理的PGC细胞经实时荧光定量核酸扩增检测(Real-time quantitative PCR,qPCR)后结果如下:GRIM19在PCOS患者PGC中mRNA的表达水平低于正常人4.13倍(P<0.001);而VEGF的mRNA表达量高于正常人4.42倍(P<0.001)。同样蛋白质免疫印迹(Western blot,WB)检测结果显示,PCOS颗粒细胞中GRIM19蛋白的表达水平低于正常人3.3倍(P<0.001);VEGF蛋白的表达水平高于正常人4.2倍(P<0.001)。说明正常人PGC中有较多的GRIM19表达,而PCOS患者的PGC中VEGF表达水平较高且伴GRIM19低表达。siRNA沉默PCOS患者PGC的GRIM19基因后,qPCR及WB检测结果显示,VEGF的mRNA和蛋白表达量分别增加了3.93倍(P<0.001)和2.47倍(P<0.001)。而GRIM19过表达质粒转染PCOS的PGC后,qPCR及WB检测显示VEGF的mRNA和蛋白表达量在PGC中分别减少2.11倍(P<0.001)和2.40倍(P<0.001)。说明PCOS患者PGC中VEGF与GRIM19的表达有关,且明显呈负相关。二、睾酮对PGC的GRIM19及VEGF表达的影响当不同浓度睾酮孵育正常人的PGC后,检测发现GRIM19的表达随睾酮浓度的增加而表达降低。在睾酮浓度为1×10~-44 mmol/L时,GRIM19的表达量低于阴性对照组,在mRNA水平上减少了7.01倍(P<0.001),在蛋白水平上减少7.85倍(P<0.001)。与之相反,VEGF和STAT3的表达会随着睾酮浓度的增加而增加,当睾酮浓度为1×10~-44 mmol/L时,VEGF的mRNA及蛋白表达量较阴性对照组分别增加了4.54倍(P<0.001)和4.03倍(P<0.001)。同时STAT3的mRNA表达量增加了8.43倍(P<0.001)。以上结果表明睾酮可诱导STAT3、VEGF的表达增加及GRIM19的表达降低,我们因此推测在PCOS的发生和发展中睾酮可能具有十分重要的作用。三、颗粒细胞系(KGN细胞)中GRIM19对VEGF表达的调控当我们用siRNA沉默颗粒细胞系KGN细胞的GRIM19基因后,qPCR及WB结果显示KGN细胞中的VEGF在mRNA和蛋白水平分别增加了3.97倍(P<0.001)和5.11倍(P<0.001);STAT3在mRNA水平增加了3.41倍(P<0.001);p-STAT3在蛋白水平增加了3.23倍(P<0.001)。而当我们用质粒转染KGN细胞,使GRIM19过表达时,检测结果显示VEGF在mRNA和蛋白水平上分别减少了2.13倍(P<0.001)和3.09倍(P<0.001)。同样,p-STAT3在蛋白水平减少了5.47倍(P<0.001)。上述结果进一步说明GRIM19可通过STAT3通路对VEGF的表达起负调节作用。结论一、在PCOS患者的PGC中,VEGF的表达与GRIM19呈负相关。二、睾酮可诱导正常人PGC中GRIM19的表达量减少和VEGF、p-STAT3的表达水平增加,可能是由于睾酮抑制GRIM19的表达激活了STAT3信号通路所致。三、KGN细胞中同样可能是通过STAT3信号通路,使VEGF与GRIM19的表达呈负相关。