KIF18B通过Wnt/β-catenin信号通路调控宫颈癌恶性进展的机制研究

来源 :南京医科大学 | 被引量 : 0次 | 上传用户:susanna2005
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背景:宫颈癌是常见的妇科恶性肿瘤之一,发病率仅次于乳腺癌,是威胁女性生命健康的第二大杀手。全世界每年大约有新发病例50万,死亡病例27万,85%以上的新发病例和死亡病例发生在发展中国家,近年来我国发病率和死亡率都有明显增高趋势。因此寻找宫颈癌相关分子标记物和治疗靶点显得尤为重要。KIF18B是我们通过TCGA数据库筛选发现的一种潜在的宫颈癌促癌基因。本研究旨在探讨KIF18B促进宫颈癌恶性进展的相关功能和机制研究。方法:1.我们应用肿瘤基因图谱(The Cancer Genome Atlas,TCGA)数据库,分析宫颈癌数据库(TCGACESCexpHiSeqV2-2015-02-24),发现 KIF18B 在宫颈癌组织中表达明显高于癌旁正常组织。使用The Human Protein Atlas(HPA)数据库评估KIF18B在宫颈癌组织中的蛋白表达水平。利用qRT-PCR检测30对宫颈癌和癌旁组织中KIF18B的表达水平,对宫颈癌石蜡样本行免疫组化染色,并分析KIF18B的表达与患者临床病理特征之间的关系。2.行qRT-PCR和Western blot实验检测KIF18B在常用宫颈癌细胞系中的mRNA和蛋白表达情况。设计特异性siRNA干扰Hela和Siha细胞中KIF18B的表达,进行体内外实验探讨KIF18B对宫颈癌增殖、侵袭迁移及细胞周期、凋亡的影响。设计过表达质粒过表达C33A和Caski细胞中KIF18B的表达,体外进行细胞功能实验探讨KIF18B对宫颈癌细胞增殖、侵袭迁移的影响。3.GO分析结果显示,和KIF18B相关的基因主要与细胞周期相关,利用qRT-PCR和Western blot实验检测细胞周期相关蛋白mRNA和蛋白表达情况。4.行 Western blot 实验检测 Wnt/β-catenin 信号通路中 β-catenin、C-myc、GSK3β、p-GSK3 β的mRNA和蛋白表达情况。5.干扰Hela细胞中KIF18B表达后,TOP/FOP荧光素酶报告基因检测荧光素酶相对活性变化。6.采用Wnt/β-catenin信号通路激活剂氯化锂(LiCl)处理Hela细胞,行细胞增殖实验和细胞划痕实验观察Hela细胞增殖和侵袭迁移能力的变化,Western blot 实验检测 Wnt/β-catenin 信号通路中 β-catenin、C-myc、GSK3 β、p-GSK3β蛋白水平变化。结果:1.TCGA宫颈癌数据库分析结果示KIF18B在宫颈癌组织中的表达显著高于癌旁正常组织,且其表达和患者肿瘤大小、临床分期密切相关;HPA数据库分析发现KIF18B蛋白在宫颈癌组织中呈高表达。免疫组化染色结果显示KIF18B在宫颈癌组织中高表达,卡方检验分析结果示KIF18B表达与宫颈癌肿瘤大小、临床分期、肿瘤分化程度、脉管浸润等呈正相关。2.KIF18B在宫颈癌细胞系的表达显著高于人正常宫颈上皮细胞。干扰KIF18B表达后Hela和Siha细胞的增殖、侵袭迁移能力明显降低,并使细胞周期阻滞在G1-S期,但细胞调亡无明显改变。过表达KIF18B后C33A和Caski细胞的增殖、迁移侵袭能力明显增强。裸鼠皮下荷瘤实验结果显示,干扰KIF18B表达后肿瘤的生长速度变慢、体积变小。免疫组化染色结果显示,干扰KIF18B表达后Ki-67染色表达水平低于对照组。3.qRT-PCR和Western blot结果显示,干扰KIF18B表达后,细胞周期相关蛋白CyclinD1的表达受到了明显的抑制。4.干扰KIF18B表达后,Wnt/β-catenin信号通路下游基因β-Catenin、p-GSK3β、C-myc表达水平下降,而GSK3 β表达水平无明显改变。5.干扰KIF18B表达后,其TOP/FOP荧光素酶相对活性显著降低。6.加入Wnt/β-catenin信号通路激活剂氯化锂(LiCl)后,Hela细胞的增殖和侵袭迁移能力增强,细胞中β-catenin、C-myc、p-GSK3 β蛋白水平增加。结论:1.KIF18B在宫颈癌组织中高表达,且可能作为潜在的促癌基因参与了宫颈癌的恶性进展。2.KIF18B在宫颈癌细胞系中高表达,可促进宫颈癌细胞的增殖和迁移侵袭能力,干扰KIF18B表达可以抑制宫颈癌细胞的成瘤能力,其抑制作用可能部分是通过阻滞宫颈癌细胞周期处于G1-S期而实现的。3.KIF18B通过Wnt/β-catenin信号通路促进宫颈癌的增殖和侵袭转移。
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