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目的:沙眼衣原体(Chlamydia trachomatis,Ct)属于专性胞内寄生的原核细胞型生物,通过抑制宿主细胞凋亡以完成其发育周期,但其抑制细胞凋亡的分子机制尚未完全阐明。pORF5蛋白是由Ct质粒编码的一种分泌性蛋白,能激活PI3K/AKT通路抑制细胞凋亡,本研究试图探讨pORF5质粒蛋白与PI3K/AKT信号通路、HO-1的关系,以及HO-1是否在pORF5蛋白抗细胞凋亡中发挥作用,为阐明Ct致病机制提供实验依据。方法:1.应用LB固体培养基,37℃培养含p GEX-6p/pORF5重组质粒的XL1-blue大肠杆菌24~36h,挑选单克隆菌落接种到LB液体培养基中,置于200rpm、37℃水浴摇床,振荡过夜扩大培养,用终浓度为0.2m M的IPTG诱导GST-pORF5融合蛋白表达4h;通过谷胱甘肽-琼脂糖凝胶纯化GST融合蛋白,Pre Scission Protease切除融合蛋白GST标签,制备pORF5质粒蛋白;用BCA法测定pORF5蛋白浓度,western blotting鉴定pORF5质粒蛋白。2.pORF5蛋白以不同浓度(0、3、6、9、12μg/ml)、不同时长(4、8、12、16h)刺激He La细胞,收集不同浓度,不同时间点的细胞总蛋白,western blotting分析HO-1的表达。3.PI3K抑制剂LY294002以15μM浓度预处理He La细胞1h,再以最佳浓度pORF5蛋白(9μg/ml)刺激细胞12h,western blotting分析HO-1蛋白的表达变化和PI3K/AKT信号通路激活情况,间接免疫荧光实验检测Nrf2核转位变化。4.将He La接种于细胞培养板中培养过夜,当细胞生长在至对数生长期时,加入50ng/ml的TNFα预处理细胞1h后,按以下条件将实验分成4组:第一组:对照组;第二组:9μg/ml的pORF5质粒蛋白刺激He La细胞12h;第三组:HO-1 si RNA处理He La细胞6h,再以pORF5蛋白(9μg/ml)刺激He La细胞12h;第四组:对照si RNA预处理He La细胞6h后,再以pORF5蛋白刺激He La细胞12h。收集并提取各组细胞蛋白,western blotting分别分析各组细胞中HO-1、Bax与Bcl-2的表达情况。结果:1.p GEX-6p/pORF5转化菌经IPTG诱导表达出分子量约54k Da的GST-pORF5融合蛋白,融合蛋白再经Pre Scission Protease蛋白酶切割GST标签后获得不含GST-tag的分子量约为28k Da的pORF5质粒蛋白,用BCA法测定pORF5蛋白浓度为1.263mg/ml。2.用浓度为3~12μg/ml的pORF5蛋白刺激He La细胞,细胞中HO-1蛋白的表达明显发生变化,并呈浓度依赖性,当pORF5浓度为9μg/ml时,HO-1的表达达到峰值,pORF5蛋白的浓度升高为12μg/ml时,HO-1蛋白的表达下降;以最佳pORF5蛋白浓度刺激He La细胞4~16h,收集不同时间点细胞总蛋白,发现HO-1上调呈时间依赖性,12h达到峰值;16h时细胞中HO-1蛋白表达下降。3.pORF5质粒蛋白能促进PI3K/AKT磷酸化,使用PI3K/AKT抑制剂LY294002预处理He La细胞后,western blotting检测结果发现,LY294002抑制剂处理组HO-1蛋白的表达量明显降低,较pORF5质粒蛋白单独刺激组细胞降低83%,差异具有统计学意义(P<0.01);间接免疫荧光检测结果发现,pORF5蛋白刺激组He La细胞中Nrf2核转位明显,但经LY294002与pORF5共处理组无明显Nrf2核转位。4.He La细胞分别用不同因素处理后,收集并提取细胞总蛋白,western blotting检测细胞HO-1、Bax与Bcl-2表达水平。结果发现:HO-1 si RNA能有效抑制HO-1蛋白的表达,与对照组相比较,HO-1的表达量减少84%(P<0.01)。pORF5质粒蛋白能使TNFα诱导的Bax蛋白的表达量降低43%(P<0.05),Bcl-2蛋白的表达量升高112%(P<0.05)。TNFα处理组Bax/Bcl-2比值为1.26,TNFα与pORF5质粒蛋白共同处理组Bax/Bcl-2比值为0.34,较TNFα处理组降低73%,差异具有统计学意义(P<0.01)。5.当使用HO-1 si RNA敲低HO-1表达后,Bax表达量较对照组升高31%,Bcl-2表达量降低88%,HO-1 si RNA处理组Bax/Bcl-2比值为3.6451,为对照组Bax/Bcl-2比值的10.6倍,差异具有统计学意义(P<0.01),对照si RNA对Bax/Bcl-2比值无明显影响。结论:沙眼衣原体pORF5质粒蛋白通过激活PI3K/AKT通路、促进Nrf2核转位,上调HO-1蛋白的表达抑制细胞凋亡。