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肺癌(lung cance,LC)是目前全世界范围内发病率和死亡率最高的恶性肿瘤。其中肺腺癌(lung adenocarcinoma,LUAD)是肺癌最常见的病理类型。由于在初次确诊时常为临床分期Ⅲ、Ⅳ期,伴有淋巴结或者远处转移现象,以及对传统放、化疗方法不敏感,肺腺癌的五年生存率极不理想。Micro RNAs(mi RNAs)是一类广泛存在于动植物体内的保守非编码单链RNA。它具有转录后调控靶基因表达的特点,几乎参与调节所有生物学行为。肿瘤中mi RNAs表达异常,作为癌基因或抑癌基因参与调节肿瘤发生发展过程,并与肿瘤的诊断、治疗以及预后密切相关。Mi R-520c-3p是一种尚未被广泛认识的mi RNA,仅在乳腺癌、肝癌、弥漫性大B细胞淋巴瘤中被证实低表达并发挥肿瘤抑制功能。我们之前的研究表明mi R-520c-3p在肺腺癌中表达下调,使受它调控的胸腺基质淋巴生成素(Thymic stromal lymphopoietin,TSLP)表达升高,促进了调节性T细胞(Regulary T cells,Tregs)的分化和趋化,在肿瘤免疫抑制中发挥重要作用。本研究将进一步探讨mi R-520c-3p对于肺腺癌细胞的生物学特性具有怎样的调节作用,以及其发挥作用的分子生物学机制。即从肿瘤细胞和免疫微环境两方面探索mi R-520c-3p的作用,从而为其调节肺腺癌的进展和转移的作用和机制提供新的线索。目的:1.研究mi R-520c-3p在肺腺癌的表达特点以及生物学功能;2.研究mi R-520c-3p调节肺腺癌发生发展的的分子机制,验证该mi RNA能否通过靶基因直接调控肿瘤细胞的生物学行为,并研究参与的信号通路。方法:1.利用real-time PCR技术,我们检测165例肺腺癌组织样本及对应癌旁组织中mi R-520c-3p的表达水平,并收集整理患者预后信息。运用统计学方法分析肺腺癌与对用癌旁组织中mi R-520c-3p表达水平差异,并进行生存分析。采用real-time PCR技术验证瞬时转染mi R-520c-3p mimics或inhibitor的效率,检测mi R-520c-3p过表达或敲降的肺腺癌细胞的生物学功能。检测方法包括WST方法检测细胞的增殖能力、流式细胞术双染AnnexinⅤ/PI检测细胞凋亡、transwell小室和划痕实验检测细胞的迁移、transwell小室(含matrigel gel)试验检测细胞浸润能力。2.运用生物信息学筛选mi R-520c-3p的可能靶基因。通过real-time PCR方法检测肺腺癌组织中内源性mi R-520c-3p与可能靶基因的m RNA水平。利用瞬时转染技术改变肺腺癌细胞中mi R-520c-3p含量后用real-time PCR和western blot方法检测可能靶基因m RNA和蛋白质水平。最终用双荧光素酶报告基因实验鉴定候选靶基因是否正确。研究靶基因的生物学功能时采用瞬时转染技术改变该基因表达水平,检测细胞生物学功能变化(需要使用瞬时转染技术、WST检测增殖、流式细胞术双染AnnexinⅤ/PI检测细胞凋亡、transwell小室检测细胞运动能力)。为研究mi R-520c-3p抑制肺腺癌发生发展的分子机制进行营救实验(rescue experiment),进一步验证mi R-520c-3p与其直接靶基因间是否存在细胞学功能上的调控关系。运用western blot方法检测参与调节作用的信号通路。结果:1.Mi R-520c-3p在肺腺癌组织中表达水平低于对应癌旁组织。分析其表达水平与患者预后的相关性,在肺腺癌早期(TNMⅠ)mi R-520c-3p相对表达水平高的患者预后优于相对表达水平低组,提示mi R-520c-3p高表达在肺腺癌早期(TNMⅠ)可能是保护性因素。2.瞬时转染mi R-520c-3p mimics能够明显升高肺腺癌细胞系LTEP-A-2、Glc-82和A549内的mi R-520c-3p表达水平;选用mi R-520c-3p内源性表达最高的A549瞬时转染mi R-520c-3p inhibitor,A549内mi R-520c-3p表达水平没有明显变化。以上结果提示mi R-520c-3p在肺腺癌细胞中低表达的特点。3.过表达肺腺癌细胞中mi R-520c-3p后,细胞增殖能力没有明显变化,细胞凋亡率增加、迁移细胞数和浸润细胞数减少,提示mi R-520c-3p影响了肺腺癌细胞的凋亡和迁移浸润能力。4.通过生物信息学软件预测Rab22a可能是mi R-520c-3p调控的靶基因。在肺腺癌患者的肿瘤组织中,mi R-520c-3p和Rab22a的表达水平成负相关;在肺腺癌细胞系中过表达mi R-520c-3p后,Rab22a的m RNA和蛋白质水平明显降低,与si RNA敲降细胞内Rab22a所得结果相同。并且,敲降细胞内Rab22a表达后,肺腺癌细胞的凋亡增加,迁移和浸润降低;荧光素酶报告基因实验结构显示,Rab22a野生型报告质粒在与mi R-520c-3p共转染后检测荧光值下降明显,表明Rab22a为mi R-520c-3p直接调控的靶基因;同时,我们通过营救实验进一步证实mi R-520c-3p通过Rab22a发挥作用:过表达mi R-520c-3p可减弱细胞的迁移和浸润,但同时过表达Rab22a后以上作用被逆转。总之,通过上述实验结果提示mi R-520c-3p通过调控靶基因Rab22a的表达,调节了肺腺癌细胞的迁移和浸润能力。5.当过表达肺腺癌中mi R-520c-3p时,rac1、dc42表达降低,证实Rac1/cdc42信号通路参与了肺腺癌中“mi R-520c-3p-Rab22a-肿瘤细胞生物学功能”过程。结论:1.mi R-520c-3p在肺腺癌组织和细胞系中低表达。2.早期肺腺癌(TNMⅠ)患者mi R-520c-3p表达水平与患者的预后相关。3.肺腺癌中mi R-520c-3p具有促进肿瘤细胞凋亡、抑制肿瘤细胞迁移和浸润的能力,发挥抑癌基因功能。4.Rab22a是mi R-520c-3p的直接靶基因,mi R-520c-3p可直接与Rab22a m RNA3’UTR互补结合抑制Rab22a蛋白质表达。5.mi R-520c-3p通过抑制Rab22a表达而抑制肺腺癌的迁移和浸润能力。6.Rac1/cdc42信号通路参与调节肺腺癌“mi R-520c-3p-Rab22a-肿瘤细胞生物学功能”过程。