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本研究目的在于探索谷氨酰胺对高温应激奶牛乳腺上皮细胞的保护作用,试验先分析了不同浓度、不同处理时间的谷氨酰胺对体外培养奶牛乳腺上皮细胞生长、增殖及HSP70的诱导效果,确定了诱导奶牛乳腺上皮细胞HSP70表达的最佳剂量及处理时间。在此基础上,进一步研究了谷氨酰胺对高温应激奶牛乳腺上皮细胞增殖、凋亡及相关基因表达的影响,以期为研究奶牛乳腺上皮细胞抵御高温应激提供理论依据。本研究分为三个部分: 一、谷氨酰胺对奶牛乳腺上皮细胞生长、增殖及HSP70mRNA表达的影响 奶牛乳腺上皮细胞生长至铺满80%底壁时,更换无谷氨酰胺的DMEM培养液培养过夜,取对数生长期的细胞用于试验。细胞在含有不同浓度(0、0.5、1、2、4、8、16mmol/L)谷氨酰胺的DMEM培养液中培养24h,收取细胞及细胞培养液;细胞在含有8mmol/L的DMEM培养液中培养不同时间(0、3、6、12、24、48、72h)后,收取细胞及细胞培养液。利用MTT法检测细胞存活率、比色法检测乳酸脱氢酶(LDH)活性、SYBR GreenⅠ荧光定量PCR分析HSF-1和HSP70的表达水平。结果表明:(1)谷氨酰胺能促进奶牛乳腺上皮细胞的生长存活,当剂量为2mmol/L时细胞存活率最高,为对照组的1.46倍(P<0.01),剂量为4~8mmol/L时仍维持较高水平;与对照组相比,8mmol/L的谷氨酰胺诱导6h细胞存活率明显增加,12h细胞存活率达90.55%,为对照组的1.24倍,72h细胞存活率有所下降。(2)在一定的剂量范围内,随着谷氨酰胺剂量的增加,细胞的LDH活性逐渐降低,当剂量为2~8mmol/L时LDH活性较低,而后逐渐上升;8mmol/L的谷氨酰胺诱导奶牛乳腺上皮细胞,3h细胞的LDH活性开始降低,6~24h细胞LDH活性较低,而后逐渐上升。(3)HSP70mRNA与HSF-1mRNA的表达趋势相一致,与对照组相比,8mmol/L的谷氨酰胺诱导奶牛乳腺上皮细胞24h,HSP70mRNA和HSF-1mRNA表达量均达峰值,48h仍维持较高水平。提示谷氨酰胺能促进奶牛乳腺上皮细胞的生长、增殖,并通过启动HSF-1mRNA的转录活性诱导基础状态乳腺上皮细胞高表达HSP70mRNA,存在一定的量效和时效双重效应。 二、热应激诱导奶牛乳腺上皮细胞凋亡及对Bcl-2、Bax和HSP70表达的影响 奶牛乳腺上皮细胞生长至铺满80%底壁时,取对数生长期的细胞用于试验。将37℃正常培养的乳腺上皮细胞放置于39℃/41℃热处理1h,在恢复培养的第0h、6h、12h收集细胞。采用MTT检测细胞生长的相对抑制率、流式细胞仪检测细胞凋亡、RT-PCR分析Bax/Bcl-2转录水平、SYBR GreenⅠ荧光定量PCR分析HSP70的表达水平、比色法分析Caspase-3活性。结果表明:(1)39℃诱导组热恢复0h、6h、12h细胞抑制率分别为14.07%(P>0.05)、28.13%(P<0.05)和22.02%(P<0.05),41℃诱导组热恢复0h、6h、12h细胞抑制率分别为17.13%(P<0.05),39.76%(P<0.01)和43.73%(P<0.01)。(2)39℃诱导组细胞最大死亡率发生在热修复6h左右,死亡率为15.42%;41℃诱导组细胞最大死亡率出现在热修复12h左右,死亡率高达23.18%,且早期凋亡细胞和晚期凋亡/坏死率均呈现直线上升趋势。(3)39℃诱导组热恢复第6h Bax/Bcl-2的比值达最大值,为对照组的2.32倍(P<0.05);41℃诱导组Bax/Bcl-2的比值随着热修复时间的延长而逐渐上升,热恢复第6h、12h该比值极显著高于对照组,分别为对照组的3.56倍(P<0.01)、4.33倍(P<0.01)。(4)39℃诱导组热恢复第6h HSP70mRNA表达量显著高于对照组(P<0.05),41℃诱导组热恢复第0h、6h、12hHSP70mRNA的表达量分别为对照组的3.53倍(P<0.05)、5.61倍(P<0.01)和2.93倍(P<0.05)。(5)高温处理后,Caspase-3活性呈上升趋势,与对照组相比,39℃诱导组在热恢复第6h Caspase-3活性显著上升(P<0.05),41℃诱导组热恢复第6h、12hCaspase-3活性分别为对照组4.55倍(P<0.01)、5.31倍(P<0.01)。提示,高温应激提高了奶牛乳腺上皮细胞Bax/Bcl-2表达比例,激活了Caspase-3活性,从而诱导乳腺上皮细胞凋亡,并随高温强度的增加而作用增强,同时高温诱导了HSP70过表达协助细胞获得热耐受性。 三、谷氨酰胺对高温应激奶牛乳腺上皮细胞增殖、凋亡及Bcl-2、HSP70和Caspase-3表达的影响 奶牛乳腺上皮细胞生长至铺满80%底壁时,取对数生长期的细胞用于试验。细胞分组如下:对照组(C)、谷氨酰胺组(Gln)、高温组(T)、谷氨酰胺十高温处理组(Gln+T)。利用MTT法检测细胞存活率、流式细胞仪检测细胞凋亡、SYBR GreenⅠ荧光定量PCR分析Bcl-2和HSP70的表达水平、比色法分析Caspase-3活性。结果表明:谷氨酰胺预处理使高温应激乳腺上皮细胞热恢复6h细胞存活率提高了32.45%(P<0.05),早期凋亡率下降35%(P<0.05),晚期凋亡/坏死率下降31.09%(P<0.05);谷氨酰胺预处理奶牛乳腺上皮细胞24h后,细胞内已有了一定的HSP70储备,再通过41℃热处理1h后,HSP70表达进一步提高(P<0.05);与对照组相比,谷氨酰胺诱导奶牛乳腺上皮细胞Bcl-2mRNA表达提高111.51%(P<0.05),降低了高温应激引起的Caspase-3活性(P<0.05)。提示,谷氨酰胺预处理促进了Bcl-2和HSP70表达,缓解了高温应激引起的Caspase-3活性上升,抑制了热应激所致的乳腺细胞凋亡。