基于游离和固定化细胞技术制备生物乙醇的基础研究

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木质生物质被认为是全世界最丰富的可再生资源,木质纤维素也被认为是廉价的、有前景的燃料乙醇生产原料。以纤维素类农业废弃物为原料的第二代燃料乙醇能减少废弃物和环境污染,且能减少对化石燃料能源的依赖。由于某些物理、化学因素阻碍了木质纤维素中纤维素和半纤维素的转化和利用,木质纤维素中的纤维素成分很难直接被微生物利用转化为乙醇,需要先进行预处理脱除木质素或半纤维素,破坏纤维素的结晶结构,从而提高纤维素水解糖化的效率。本文以农业废弃物为原料,对木质生物质进行预处理,纤维素酶的生产,木质生物质酶解糖化和生产乙醇工艺进行了比较系统的研究。对木质纤维素对预处理进行了分析,以大幅度降低木质纤维素原料中的木质素和半纤维素含量,使其有利于后续的酶解和发酵。结果表明,最佳预处理工艺为:微波功率540 W,加热时间30 min,氢氧化钠质量分数为2.5%,液固比为10:1(V:m)。在该条件下,还原糖含量为74.09%。对黑曲霉生产纤维素酶的工艺条件进行了深入的研究,主要研究结果如下:固态发酵(SSF)产率比连续发酵(SF)和液态发酵(SmF)产率高2倍,其中外切葡聚糖酶和内切葡聚糖酶分别为315.7 U/g纤维素和79.28 U/g纤维素。外切葡聚糖酶和内切葡聚糖酶活性在60-C条件下活性最高。采用脱木素锯末和海藻酸钠固定化酵母细胞,同时考察了固定化酵母细胞产乙醇的效果,使用不同浓度的海藻酸钠与脱木素锯末包埋酵母细胞,分批发酵的结果表明:最优的固定酵母细胞强化处理的方案为:海藻酸钠浓度为2.5%,海藻酸钙-脱木素锯末比为1:1.5。然后利用固定和游离化细胞技术对最优预处理条件下的稻草进行发酵生产乙醇,接种固定化酵母细胞发酵96h后,乙醇浓度为0.370g/g的理论乙醇产率。以固定化酵母细胞,进行重复批次循环发酵,连续9个批次,探究固定化酵母重复发酵性能。第1-6批次平均乙醇生产强度为0.35g/g的理论乙醇产率。为了对数据进行分析,本文采用了响应曲面法Box-Behnken Design(BBD)设计原理,对木质纤维素进行预处理来生产纤维素酶、糖化酶解、和生产乙醇过程进行优化,为了获得高活性酶。考察了影响黑曲霉固态发酵生产纤维素酶的发酵条件,结果黑曲霉接种量(%w/w),湿度(%v/w),稻草秸秆添加量(%w/w)为对纤维素酶产量有显著影响的主要因素,最适宜条件为:黑曲霉接种量10.5%,湿度79%,稻草秸秆添加量15g。在此BBD响应面模型优化条件下,制备黑曲霉固态发酵生产纤维素酶理论值可达到95.86 U/g纤维素,经验证,实际纤维素酶产量(95.86 U/g纤维素)与预计产量相差0.61%。对稻草秸秆添加量、反应时间和纤维素酶用量主要因素同样采用响应曲面法进行了糖化酶解优化分析。研究结果显示:当稻草秸秆添加量为11.09%、反应时间为48.78h、酶液用量89.95 U/g时,糖化得率可达到55.54%。验证试验证实了该方程的预测值与试验值之间具有较高的拟合度。另外,采用响曲应面分析方法,发现pH值(4~5.5)、发酵时间(24~72 h)、和固体添加量(15~20%w/v)对燃料乙醇产量有显著的影响,最适宜条件为:pH值为4.5、发酵时间为56.42h、和15.16%的固体添加量。在最优条件下,乙醇产率为0.4451g/g。
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