目的研究脊髓小胶质细胞TLR4/My D88/NF-κB信号通路在脓毒症致骨骼肌功能障碍和烟碱型乙酰胆碱受体(nicotinic acetylcholine receptor,nAChR)异化重构中的作用和机制;验证乌司他丁(Ulinastatin,ULI)是否通过抑制脊髓小胶质细胞TLR4/My D88/NF-κB信号通路从而减轻脓毒症致骨骼肌功能障碍和nAChR异化重构;比较脓毒症骨骼肌细胞表达的两种nAChR(α7-nAChR和γ-nAChR)的内向电流大小。方法第一部分选取健康成年雄性Sprague–Dawley(SD)大鼠,鼠龄2~3月,体重220~240 g。采用随机数字表法,将成年大鼠随机分为2组,即假手术组(Sham组,n=6)和脓毒症组(Sepsis组,N=60)。脓毒症组根据建模后时间的不同,再分为建模后2 h组(Sepsis-2h,n=10)、建模后4 h组(Sepsis-4 h,n=10)、建模后6 h组(Sepsis-6 h,n=10)、建模后12 h组(Sepsis-12 h,n=10)、建模后24 h组(Sepsis-24 h,n=10)和建模后48 h组(Sepsis-48 h,n=10)。脓毒症模型采用盲肠结扎穿刺术(cecal ligation and puncture,CLP)建立,假手术模型仅行开腹盲肠探查并缝合。脓毒症各组大鼠和假手术大鼠分别在建模后相应时间点和术后24 h对行为学和组织学改变、死亡率进行测定;采用ELISA法检测血清中白细胞介素6(IL-6)和肿瘤坏死因子α(TNF-α)水平;测量胫前肌复合肌动作电位(compound muscle action potential,CMAP)并测定其振幅和持续时间,计算运动神经传导速度(motor nerve conduction velocity,MCV),测定潜伏期(latency time);测量脊髓含水量;采用免疫荧光双标法测定脊髓组织中TLR4和Iba-1的表达和分布;采用Western blot法测定脊髓组织中TLR4、My D88、p-IκB-α、IκB-α、NF-κB和胫前肌组织中γ-nAChR、α7-nAChR和neuregulin-1的蛋白表达量。第二部分选取2~3月龄的健康成年雄性SD大鼠,体重220~240 g,随机分为Sham组(n=6)和Sepsis组(N=50)。其中Sepsis组又分为5个亚组:TLR4特异性抑制剂(TAK-242)组(0.02 mg/kg TAK-242,n=10)、1 000 U/kg ULI组(n=10)、3 000 U/kg ULI组(n=10)、5 000U/kg ULI组(n=10)和0.9%N.S组(n=10)。在建模前60 min通过鞘内注射分别将5μl相应浓度的ULI、TAK-242和0.9%N.S注入大鼠脊髓L3~L4节段中,随后分别按第一部分建模方法建立假手术和脓毒症模型。各组均在建模后24 h进行与第一部分相同的指标检测,方法同第一部分。第三部分选取2~3月龄的健康成年雄性昆明(Kunming mice,KM)小鼠,体重50~60 g,分为正常对照组(Control组)、假手术组(Sham组)和脓毒症组(Sepsis组),按第一部分建模方法建立假手术和脓毒症模型,各组在建模后24 h取小鼠右下肢的拇短屈肌和胫前肌。拇短屈肌用0.2%Collagenase I A在37℃消化3 h分离单个骨骼肌细胞。使用全细胞膜片钳检测其在接受乙酰胆碱(ACh)、Ach+?-nAChR特异性阻断剂(waglerin-1)、Ach+waglerin-1+α7-nAChR特异性阻断剂(Methyllycaconitine,MLA)和Ach+waglerin-1+MLA+nAChR非特异性阻断剂(α-Bungarotoxin,α-BTX)作用时的内向电流,并对电流大小进行比较。用Western blot法检测胫前肌中α7-nAChR和γ-nAChR的蛋白表达量,方法同实验第一部分。结果第一部分(1)行为学的比较:与Sham组比较,Sepsis大鼠在建模后进食减少,毛发竖起,活动减少,身体蜷缩,对抓取反应较差;水平活动距离和直立次数明显减少(P<0.05);(2)组织学的比较:与Sham组比较,Sepsis组大鼠在术后24 h可见腹部膨隆,排出稀水样便,有脓性尿,眼角处有脓性分泌物打开腹腔,可闻及明显恶臭味,肺、肠和脾组织结构明显受到损伤;(3)死亡率的比较:建模后24 h,Sham组没有大鼠死亡(n=6),死亡率为0%。在建模200 min后Sepsis组出现第一只大鼠死亡。Sepsis组的总死亡率约为37%(2 h组1只,4 h组2只,6 h组4只,12 h组5只,24 h组5只,48 h组5只);(4)血浆中炎症因子的比较:与Sham组比较,Sepsis各组的炎症因子(TNF-α和IL-6)随时间增加而增加,且差异有统计学意义(P<0.05);(5)CMAP相关指标的比较:(1)与Sham组比较,Sepsis各组的CMAP幅值随时间增加而降低,差异有统计学意义(P<0.05);(2)与Sham组比较,Sepsis各组的CMAP持续时间随时间增加而延长,差异有统计学意义(P<0.05);(3)与Sham组比较,Sepsis各组的MCV随时间增加而增加,差异有统计学意义(P<0.05);(4)与Sham组比较,Sepsis各组的潜伏期随时间增加而延长,差异有统计学意义(P<0.05);(6)脊髓含水量和炎症因子的比较:与Sham组比较,Sepsis各组的脊髓重量随时间增加而增加,且差异有统计学意义(P<0.05);与Sham组比较,Sepsis各组脊髓中的TNF-α和IL-6随时间增加而增加,且差异有统计学意义(P<0.05);(7)脊髓中TLR4/Iba-1分布的比较:与Sham组比较,Sepsis各组脊髓中的TLR4/Iba-1的表达随时间增加而增加,且分布广泛,差异有统计学意义(P<0.05);(8)蛋白表达的比较:与Sham组比较,Sepsis各组脊髓组织中TLR4、My D88、p-IκB-α和NF-κB的表达随时间增加而增加,IκB-α的表达随时间增加而减少,差异有统计学意义(P<0.05);与Sham组比较,Sepsis各组胫前肌组织中γ-nAChR和α7-nAChR的表达随时间增加而增加,neuregulin-1的表达随时间增加而减少,差异有统计学意义(P<0.05)。第二部分(1)行为学的比较:与Sham组和0.9%N.S组比较,TAK-242组和5 000 U/kg ULI组在建模后24 h的状态明显好转;水平活动距离和直立次数明显增加(P<0.05);(2)组织学的比较:与Sham组和0.9%N.S组比较,TAK-242组和5 000 U/kg ULI组在建模后24 h的肺、肠和脾组织结构有一定程度好转,但腹腔内仍有腹水存在,结扎的肠管处于水肿和坏死状态;(3)死亡率的比较:与Sham组和0.9%N.S组比较,TAK-242组和5 000 U/kg ULI组在建模后24 h的死亡率明显减少,且差异有统计学意义(P<0.05);(4)血浆中炎症因子的比较:与Sham组和0.9%N.S组比较,TAK-242组和5 000 U/kg ULI组血浆中炎症因子的水平明显降低,且差异有统计学意义(P<0.05);(5)CMAP相关指标的比较:(1)与Sham组和0.9%N.S组比较,TAK-242组和5000 U/kg ULI组的CMAP幅值明显增加,差异有统计学意义(P<0.05);(2)与Sham组和0.9%N.S组比较,TAK-242组和5 000 U/kg ULI组的CMAP时程明显缩短,差异有统计学意义(P<0.05);(3)与Sham组和0.9%N.S组比较,TAK-242组和5 000 U/kg ULI组的MCV明显缩短,差异有统计学意义(P<0.05);(4)与Sham组和0.9%N.S组比较,TAK-242组和5 000 U/kg ULI组的潜伏期明显缩短,差异有统计学意义(P<0.05);(6)脊髓含水量和炎症因子的比较:与Sham组和0.9%N.S组比较,TAK-242组和5 000 U/kg ULI组的脊髓重量明显减轻,且差异有统计学意义(P<0.05);与Sham组和0.9%N.S组比较,TAK-242组和5 000 U/kg ULI组的脊髓中炎症因子水平明显降低,且差异有统计学意义(P<0.05);(7)脊髓中TLR4/Iba-1分布的比较:与Sham组和0.9%N.S组比较,TAK-242组和5000 U/kg ULI组的TLR4/Iba-1分布和表达明显减少,差异有统计学意义(P<0.05);(8)蛋白表达的比较:与Sham组和0.9%N.S组比较,TAK-242组和5 000 U/kg ULI组的脊髓组织中TLR4、My D88、p-IκB-α和NF-κB的表达明显减少,IκB-α的表达明显增加,差异有统计学意义(P<0.05);TAK-242组和5 000 U/kg ULI组的胫前肌组织中γ-nAChR和α7-nAChR的表达明显减少,neuregulin-1的表达明显增加,差异有统计学意义(P<0.05)。第三部分(1)蛋白表达的比较:与Control组和Sham组比较,Sepsis组中胫前肌组织中γ-nAChR和α7-nAChR的表达明显增加,差异有统计学意义(P<0.05);(2)ACh的EC50大小:ACh激活骨骼肌nAChR通道的EC50为84.00±0.016μmol/L;(3)各组在ACh作用下内向电流大小的比较:与Sham组比较,Sepsis组nAChR内向电流明显降低,差异有统计学意义(1133.48±475.12 vs 563.68±138.26,P<0.05);(4)不同阻断剂EC50的大小:在Sepsis组中,waglerin-1阻断骨骼肌?-nAChR通道的EC50为0.60±0.02μmol/L;MLA阻断骨骼肌α7-nAChR通道的EC50为0.30±0.34μmol/L;α-BTX阻断骨骼肌nAChR通道的EC50为0.65±0.01μmol/L;(5)各组在ACh和不同阻断剂同时作用下内向电流大小的比较:在Sepsis组中,与单加入ACh比较,加入waglerin-1后nAChR的内向电流明显降低(548.96±163.65 vs.135.25±39.85,P<0.05);加入waglerin-1和MLA后,nAChR的内向电流进一步降低(135.25±39.85vs.86.21±28.78,P<0.05);再加入α-BTX后,nAChR的内向电流几乎被全部阻断(86.21±28.78 vs.12.32±3.25,P<0.05)。结论(1)脓毒症激活脊髓小胶质细胞TLR4/My D88/NF-κB信号通路导致的脊髓炎症反应与外周神经肌肉功能障碍和nAChR的异化重构有关;(2)鞘内注射5000 U/kg乌司他丁可通过抑制脊髓小胶质细胞TLR4/My D88/NF-κB信号通路减轻脓毒症引起的脊髓炎症反应,进而改善神经肌肉功能障碍和下调γ-nAChR和α7-nAChR的表达;(3)脓毒症时,ACh引起的骨骼肌细胞内向电流主要由?-nAChR产生,小部分由α7-nAChR和γ-nAChR产生,其中又以γ-nAChR的为主。