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草鱼(Ctenopharyngodon idellus)是中国传统的养殖品种,养殖规模较大。草鱼出血病制约了我国草鱼产量的提升,该病是由草鱼呼肠孤病毒(Grass Carp Reovirus,GCRV)感染引起的病毒性疾病。GCRV病毒为呼肠孤病毒科(Reoviridae)、水生呼肠孤病毒属(Aquareovirus),无囊膜,具有双链RNA结构,最外层衣壳蛋白由VP5和VP7组合形成。本研究通过鉴定GCRV病毒外衣壳蛋白与宿主受体的相互作用关系,阐释了GCRV吸附和进入宿主的机制,主要研究结果如下:1.GCRV利用Laminin receptor(Lam R)介导其识别吸附宿主细胞我们通过酵母双杂交实验,筛选草鱼cDNA文库中与GCRV外衣壳蛋白VP5或VP7相互作用的蛋白,发现GCRV-VP5能够与层黏连蛋白受体蛋白(Laminin receptor,LamR)在酵母杂交系统中发生相互作用,而VP7没有筛选到类似的受体蛋白。利用Race扩增技术我们获得了草鱼LamR的基因全长;激光共聚焦显微镜观察显示,GCRV病毒粒子吸附CIK细胞后,能够与细胞膜上的LamR发生共定位;原核表达系统纯化的LamR-gst与GCRV病毒粒子进行Dot-blot overlay表明,LamR-gst能够与GCRV发生特异性的吸附。利用真核转染系统表达GCRVVP5和GCRV-VP7 GFP融合蛋白与LamR-gst,进行GST Pull-Down和Dot-blot overlay等实验表明,LamR能够与GCRV-VP5发生相互作用,而与GCRV-VP7不能发生相互作用;RNAi敲降CIK细胞中的LamR后,吸附感染GCRV显示,LamR敲降后能够显著性的降低GCRV的吸附感染效率;制备LamR的多抗,封闭CIK细胞后发现,能够显著性的降低GCRV的感染效率;推测GCRV利用外层衣壳蛋白VP5来识别宿主细胞膜上的受体LamR,从而介导其吸附宿主细胞;2.EGCG((-)-epigallocatechin-3-gallate)能够拮抗GCRV感染宿主细胞基于现有研究显示,EGCG能够结合细胞膜上的LamR,体外等离子共振实验表明,EGCG和LamR具有显著的结合活性。我们尝试利用EGCG封闭宿主细胞膜上的LamR干扰GCRV的吸附途径,从而拮抗GCRV感染。实验结果表明,随着封闭CIK细胞的EGCG或GTE浓度的升高,GCRV吸附和感染的效率显著2性的降低。通过不同浓度EGCG和EGCG粗提物(Green tea,GTE)处理CIK细胞后,检测CIK细胞的生理活性,评价了EGCG和GTE的安全浓度。综上,EGCG和GTE能够有效的拮抗GCRV吸附和感染宿主细胞。3.GCRV依赖于Clathrin-dependent内吞途径进入CIK细胞本研究应用多种内吞途径抑制剂处理CIK细胞后,感染GCRV探讨其进入水平,研究了GCRV进入宿主细胞的机制。实验结果显示,GCRV感染CIK细胞能够被氯丙嗪(Chlorpromazine)显著性抑制,而Filipin III、Nystatin和LY294002对其没有干扰效果,推测其可能利用了Clathrin途径。氯喹(Chloroquine)和氯化铵(Ammonium chloride)预处理CIK细胞能够显著性的降低GCRV的感染进入效率,表明GCRV进入宿主细胞依赖于酸性的内吞途径。Dynasore抑制剂干扰CIK细胞中dynamin,实验表明GCRV需要依赖于Dynamin参与的内吞途径。共聚焦显微镜观察GCRV病毒粒子和Clathrin定位情况表明,GCRV病毒粒子能够与Clathrin蛋白共定位。综上,我们证实GCRV病毒粒子进入宿主细胞需要在低pH环境下,通过Dynamin蛋白的辅助依赖于clathrin介导的内吞途径完成。