人红细胞膜上只存在一种葡萄糖运输体---GLUT1（glucose transporter 1）。编码它的基因位于第一染色体上，已被纯化、克隆并测序。人的GLUT1是492个氨基酸组成的糖蛋白质，分子量约55KDa，在SDS-PAGE上为Band 4.5。对GLUT1的定点酶解和抗体结合研究确认其二级结构是由12个跨膜α螺旋，有6个色氨酸残基。圆二色性光谱分析GLUT1结构含有82％的α螺旋，10％β折叠和8％的自由结构。GLUT1在每个人红细胞上有约2×10⁵个拷贝，占其膜蛋白总量的5％。有实验表明，在活性生物膜上它存在的形式有单体、二聚体、四聚体或由一个单体与其它蛋白质形成聚合。GLUT1在膜上起着对D型葡萄糖易化扩散的作用，满足细胞生成ATP和合成含糖大分子的需要。和GLUT1相关的疾病包括糖尿病、葡萄糖转运缺乏综合症（GTDS）、先天性肝脏动脉血管畸形、尿毒症、缺铁性贫血症、真皮血管瘤、膀胱乳突淋瘤以及不少的癌症，如尿道乳突癌、胰腺癌和胃癌。GLUT1的主要功能是能量供给，从它与大量疾病的联系就可以看出，它的功能的上升下降与各种组织细胞的各种功能都是相关联的。所以研究GLUT1与其它蛋白之间的功能和结构关系对解释细胞整体功能运作和今后的疾病诊断和治疗都有很大贡献。我们的实验主要研究GLUT1与人红细胞上另外一种重要的膜蛋白Band 3之间的关系。Band 3的主要功能是介导对阴离子的跨膜转运，由此使体内CO₂和外界O₂得以顺利交换。首先，我们使用一种Band 3的交联剂BS³（双磺基琥珀酰亚胺辛二酸盐）和光学实时观测法，观察GLUT1和Band 3之间功能上的联系。BS³是一种不能透过膜的Band 3共价交联剂，Band 3亚基的共价交联必然会改变在红细胞膜上Band 3二聚体和四聚体间的动态平衡状态，使运输位点受到影响。通过NO₂^-的跨膜通透速率测定表明，BS³能抑制阴离子的运输，4例血样抑制运输的ID₅₀为0.63±0.15 mmol/L。同时，葡萄糖输入和输出的速率也随之明显减小：对葡萄糖的输入，6例血样ID₅₀为0.77±0.21 mmol/L；但对葡萄糖的输出，BS³的抑制效应要小些，在6 mmol/L BS³处理后6例血样葡萄糖输出速率为对照的（84.0±5.6）％。这表明，GLUT1的细胞膜外侧比内侧更易受到BS³的影响。SDS-PAGE结果显示单体Band3减少，GLUT1的量无明显变化。因而我们有理由认为，BS³对葡萄糖跨膜运输的影响不是其对GLUT1直接结合所造成的。所以以上结果表明在膜上Band 3和GLUT1之间存在相互作用以实现膜蛋白功能快速和协同的发挥，但是并不清楚两者是以“跨膜运输复合体”形式存在还是通过膜骨架蛋白间接作用。接着，我们运用分子生物学手段进一步研究GLUT1与Band 3结构上的直接关系。以前的研究表明GLUT1的功能位点主要集中在几个胞质段，对GLUT1的胞质段的功能结构研究有以下几点：1．GLUT1和其它蛋白质的大部分相互作用的功能都是通过胞质段完成的，尤其是它的羧基端、氨基端和连接跨膜段6和7、8和9之间的胞质肽环。2．GLUT1的羧基端与其它胞质段结构的相互作用阻止了葡萄糖的净流入。3．胞质段结构形成ATP依赖的胞质段葡萄糖结合位点，这个结构在鸟类的红细胞中阻止葡萄糖的净流出，在葡萄糖运输功能不对称的人类红细胞中既阻止净流入又阻止净流出。4．这些胞质段可能是药物和阻断剂的结合位点，比如5，7，45-三羟基异黄酮和细胞色素B。基于这些知识，我们先表达GLUT1的羧基端、氨基端及胞质段，然后研究它们与Band 3的约43kDa的氨基端胞质段（cdb3）之间的相互作用。我们成功地在E．coli中克隆了连接各种接头（GST，Trx，His₆）的GLUT1全长及其片段蛋白：羧基端（GLUT1-Ct）、氨基端（GLUT1-Nt）和连接跨膜段6和7之间的胞质肽环（GLUT1-1oop），最终表达和纯化出几种融合蛋白，包括Trx-GLUT1-Nt，Trx-GLUT1-Ct，GST-GLUT1-Nt，GST-GLUT1-Ct和GST-GLUT1-1oop。用离子交换层析、亲和层析和分子筛纯化得到了大量纯化的GLUT1-Ct和cdb3的重组蛋白。通过Protein A/G进行的免疫共沉淀实验（Co-IP）和通过Glutathione柱介质进行的pull-down实验并以SDS-PAGE和Western blot进行检测，研究了这两种蛋白质之间的相互作用。我们使用了cdb3与ankyrin D34这两种明确作用的蛋白质作为系统的阳性对照，在Co-IP和pull-down实验中，其结果均为阳性。在Co-IP实验中，观察到了Trx-GLUT1-Ct可以将（N/C）His₆-cdb3免疫共沉淀，反之（N/C）His₆-cdb3也可以将Trx-GLUT1-Ct免疫共沉淀，其中，阴性对照组Trx与（N/C）His₆-cdb3的Co-IP的反应结果为阴性。另外，在pull-down实验中，观察到了结合在Glutathione柱介质上的GST-GLUT1-ct能结合（N/C）His₆-cdb3；同时，将GST-cdb3接在Glutathione柱介质上也可以结合Trx-GLUT1-Ct，而GST阴性对照组分别与（N/C）His₆-cdb3和Trx-GLUT1-Ct的pull-down实验结果均为阴性。以上重组蛋白进行的体外实验的结果表明，在GLUT1和Band 3之间确实存在着直接的相互作用，其作用位点包括GLUT1的羧基端胞质段和Band 3的氨基端胞质段。目前，我们还在继续进行GLUT1的其它片段与cdb3相互作用的实验。结合前面生理状态下红细胞膜上GLUT1和Band 3之间存在功能上相互作用的结果，分子生物学实验进一步证明了膜蛋白在功能上的协同性是通过蛋白质之间直接结构上的相互作用（很可能通过“跨膜运输复合体”的形式）实现的。对于红细胞，往往在体内毛细血管等处阴离子转运活跃处，也要求红细胞有更大的变形性，即细胞需更多葡萄糖，这也是Band 3和GLUT1存在相互作用的一种生理学意义。