在大气中广泛存在的超细颗粒物是一种典型的纳米级颗粒物,它们主要来自工业废气和汽车尾气的排放、人工合成以及自然活动。超细颗粒物对人体的暴露主要发生于空气污染严重的生活区域以及与超细颗粒物相关的生产活动中。超细颗粒物对生物体的暴露可以引发严重的炎症反应以及呼吸道疾病,并且可以穿过肺泡进入血液循环并最终导致其他器官的炎症反应。作为一种主要由人工合成并被广泛应用的超细颗粒物,超细炭黑被广泛地应用于印染、橡胶合成、喷漆、印刷等行业。基于以上原因,超细炭黑对人体潜在的毒性危害越发受到人们重视,其毒性的研究也被广泛开展。超细炭黑是一种炭基的超细颗粒物,其粒径一般小于100 nm,本文中研究的两种超细炭黑粒径分别为13nm和50nm,根据这两种炭黑在不同分散体系中的溶解度差异,我们将其分别用于细胞毒理学和分子与动物毒理学的研究中。现有的研究表明超细炭黑可以诱发小鼠的呼吸道疾病并对小鼠的肺产生氧化应激损伤,然而超细炭黑可以通过进入血液循环系统对生物体内的细胞和生物大分子造成损伤,目前关于超细炭黑在细胞和分子水平上的毒性研究尚未有报道;此外,目前研究超细炭黑的模型动物大都是哺乳动物,由于超细炭黑被广泛用于土壤和水的治理以及农业中,超细炭黑进入水环境的概率大幅上升,然而很少有文献报道超细炭黑对水生生物的毒性效应。因此,我们在分子、细胞以及动物水平上系统研究了超细炭黑对抗氧化酶、DNA、小鼠原代肝细胞以及斑马鱼的氧化应激毒性和基因毒性的机理。研究的内容主要分为以下六个部分:第一章主要评述了超细颗粒物在环境中的广泛分布、超细颗粒物对人体健康的危害、超细颗粒物进入生物体后与生物大分子结合形成蛋白冠的机理以及生物体内的蛋白质对超细颗粒物在生物体内分布和其毒性效应的影响;解释了超细颗粒物在生物体内和细胞内诱发氧化应激的机理,并引出了超细炭黑与超细颗粒物的关系;最后归纳了超细炭黑在人们生产生活中的广泛应用,及对人体可能产生的潜在危害。通过整理和总结目前对超细炭黑的毒性的研究,发现了待急需解决的问题,并针对这些问题制定了自己的研究方案。第二章主要对两种超细炭黑在不同分散剂中的分散效果进行了表征,选出最佳的分散体系用于对应毒理学实验的研究。本部分实验通过动态光散射、扫描电镜、透射电镜实验研究了五种不同分散剂(超纯水、吐温80、吐温20、100%乙醇溶液、完全培养基)对FW200和SB100这两种超细炭黑的分散效果。动态光散射实验的结果表明FW200和SB100均可以很好地在无水乙醇以及吐温20和吐温80这两种常用的非离子型分散剂中被分散开。此外,FW200在完全培养基中表现出较好的分散性,其在完全培养基中的分散效果优于SB100。另一方面,SB100在超纯水中分散效果明显优于FW200。因此,我们选用完全培养基作为FW200在细胞毒理学实验中的分散剂,超纯水作为SB100在分子和动物毒理学实验中的分散剂。第三章我们通过研究超细炭黑与抗氧化酶和DNA分子的相互作用揭示了超细炭黑在分子水平上对生物体可能诱发氧化应激和基因毒性的机理。抗氧化蛋白在生物体中起着消除活性氧物质(ROS)的重要作用,外源物质可以通过进入生物体破坏抗氧化蛋白的结构和功能进而诱发生物体内氧化应激的发生;研究超细炭黑与DNA分子的作用可以在分子层面揭示超细炭黑的基因毒性。因此为了在分子层面揭示超细炭黑诱发氧化应激和基因毒性的机理,我们采用紫外吸收光谱、稳态荧光光谱、同步荧光光谱、三维荧光、共振光散射、圆二色谱研究了超细炭黑与抗氧化酶和鲱鱼精子DNA(简称DNA)相互作用的机理;其次我们通过酶活性试验研究了超细炭黑对抗氧化酶的酶活力的改变;最后我们根据光谱学以及酶活性实验的结果建立了超细炭黑与抗氧化酶和DNA分子相互结合的模型以更加形象地解释二者相互作用以及结合的模式。本章总共分为四个部分,分别是超细炭黑对超氧化物歧化酶(SOD)、溶菌酶(LYZ)、转铁蛋白(TF)和DNA的分子毒性分析。(1)超细炭黑对SOD的分子毒性机理。超细炭黑与SOD相互作用导致了SOD结构和活力的改变。三维荧光的结果表明超细炭黑在和SOD结合后形成了一种被称为“蛋白冠”的复合物,并且使体系的粒径增大;稳态荧光和紫外吸收光谱的结果表明超细炭黑与SOD的结合使SOD的内源荧光发生猝灭,并导致了SOD的骨架更加松散,同时导致SOD的微环境疏水性减弱极性增强;我们进一步通过研究超细炭黑对SOD圆二色谱的影响发现超细炭黑显著地改变了 SOD的二级结构使其二级结构中α-helix的含量增加β-sheet的含量降低;酶活性实验结果显示超细炭黑可以在一定程度上抑制SOD的酶活力。我们在以上实验结果的基础上建立了超细炭黑与SOD结合的分子模型,从模型中可以看出超细炭黑可能通过疏水力结合在了 SOD的底物通道以及α-helix结构附近,这可能导致其底物通道的结构发生改变最终导致酶活性的降低,这种结合模式可以有力的解释超细炭黑对SOD的二级结构和酶活力的改变机理。(2)超细炭黑对LYZ的分子毒性机理。超细炭黑对LYZ的影响与对SOD的影响相似,也改变了 LYZ的结构和活力。超细炭黑与LYZ的结合导致超细炭黑-LYZ体系粒径增大;紫外吸收光谱的实验显示超细炭黑改变了 LYZ的碳骨架结构并使其发生去折叠现象,同时也改变了氨基酸之间羰基(C=O)的π→π*电子转移;荧光实验结果显示超细炭黑猝灭了 LYZ的内源荧光,改变了 LYZ内生色团的微环境,但并没有显著改变其内部环境的疏水性;圆二色谱的结果显示超细炭黑对LYZ的二级结构同样产生了影响,导致α-helix含量增加1 1%;酶活的实验显示超细炭黑对LYZ的酶活力产生了显著地抑制作用:随后根据以上实验结果建立了二者结合的模型,模型显示超细炭黑可能通过疏水力的形式结合在LYZ的酶活性中心的Trp62、Trp63、Trp108三种氨基酸残基附近。(3)超细炭黑对TF的分子毒性机理。超细炭黑与TF的相互作用机理与前两种蛋白有一定程度的不同。超细炭黑与TF的结合使TF的内源荧光强度升高,说明超细炭黑对TF结构的改变可能导致了 TF内生色团周围的猝灭基团如羰基基团与生色团的距离增大,超细炭黑也改变了 TF的碳骨架使其去折叠化并影响了 TF的二级结构使α-helix含量减少而β-sheet的含量增加,但是超细炭黑并没有对TF的疏水性产生显著影响,说明疏水力不是二者之间结合的主要作用力。最后,我们通过建立两者之间相互作用的模型更加形象地展示了超细炭黑通过结合在TF的α-helix结构上与TF发生相互作用的分子机理。(4)超细炭黑在分子水平的基因毒性。超细炭黑通过静电结合的方式与DNA发生作用,导致DNA的磷酸骨架以及含氮碱基等结构发生变化,此外,超细炭黑也对DNA的右手螺旋性产生了轻微的影响。第四章以小鼠原代肝细胞为研究对象,通过将超细炭黑对小鼠原代肝细胞进行体外暴露揭示了超细炭黑在细胞水平上对小鼠原代肝细胞的氧化应激以及基因毒性效应。经过24小时暴露,超细炭黑诱发了小鼠原代肝细胞内ROS(活性氧类物质)的升高,并刺激了细胞内过氧化氢酶活力的升高以及还原型谷胱甘肽含量的降低,超细炭黑同时也诱发了细胞内脂质过氧化的发生,导致MDA水平的升高,这一过程最终导致了小鼠原代肝细胞的细胞活力下降,凋亡水平升高以及显著的基因损伤。第五章主要研究了超细炭黑在动物水平上对斑马鱼造成的毒性影响。通过将一定量的超细炭黑溶液直接注射到斑马鱼幼鱼的卵黄中来模拟超细炭黑从母体到幼体的遗传暴露。我们在注射后不同的时间点检测了斑马鱼多个身体指标的变化从而在动物水平上阐释了超细炭黑诱发氧化应激以及基因毒性的机理。我们发现超细炭黑可以显著抑制斑马鱼的生长发育并导致斑马鱼死亡率和畸形率的升高;基因表达水平测试结果发现超细炭黑引起了斑马鱼抗氧化基因sod1/sod2的升高,视觉(opn1lw2,opon1mw1,opn1sw2)与神经系统(gfap,mbp,syn2a)相关基因表达水平的降低,说明超细炭黑导致斑马鱼体内氧化还原平衡的紊乱,影响了斑马鱼视觉以及神经系统的正常发育;进一步的研究发现超细炭黑显著抑制了斑马鱼的运动活力导致其行为异常。以上的研究表明超细炭黑通过诱发氧化应激导致了斑马鱼基因表达水平的变化以及生长发育的异常。第六章对全论文的研究内容进行了归纳总结,概括了论文的主要创新点和意义,在对全文的研究内容进行系统总结的基础上分析了研究的不足和未来研究展望。本研究以抗氧化蛋白、DNA分子、小鼠原代肝细胞以及斑马鱼为研究对象,系统地研究了超细炭黑在分子、细胞以及动物水平上的毒性效应,总结了超细炭黑对三种抗氧化蛋白的结构和功能造成影响的机制,发现了超细炭黑进入小鼠原代肝细胞内部并诱发细胞的氧化应激和基因损伤,在动物水平上证明了超细炭黑可以通过诱发斑马鱼氧化应激效应对斑马鱼的基因表达水平和生长发育产生影响。本论文系统阐述了超细炭黑在分子、细胞以及动物水平上诱发氧化应激和基因毒性的机理,有助于人们从三个不同层次了解超细炭黑的毒性和环境健康效应,为未来进一步研究超细炭黑的毒性效应和评估超细颗粒物的潜在危害以及国家制定相关政策方针管理超细颗粒的排放提供参考。